СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ АКТИВНОСТИ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В КЛЕТКЕ Российский патент 1995 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимическим методам, и может использоваться для исследования активности метаболических процессов в клетке при определении уровня индивидуального здоровья, профилактики растройств здоровья и определении эффективности терапии.

В медицине для определения уровня индивидуального здоровья широко используются биохимические методы, основанные на изучении изменений биохимических параметров, при этом забирают кровь из вены и определяют содержание холестерина, липопротеидов, триглицеринов, жирных кислот, индекс атерогенности.

Эти методы требуют большого количества крови, занимают значительное время и не дают точных показателей здоровья, поскольку эти методы не затрагивают систему клеточной адаптации, которая и определяет уровень здоровья организма.

Для возможности объективного определения уровня здоровья биохимическими методами должны использоваться показатели, удовлетворяющие требованиям адаптации они должны быть неспецифическими, изменчивыми и устойчивыми. Методы оценки метаболических процессов в клетке, т.е. методы, характеризующие мембранный метаболизм, позволяют на их основе определить уровень индивидуального здоровья и эффективность терапии, так как интенсивность мембранного метаболизма резко изменяется при изменении внутренней и внешней среды и жестко коррелирована с состоянием здоровья.

Известен, например, способ исследования метаболических процессов в клетке, основанный на определении клеточной электрической резистентности эритроцитов как функции времени.

Однако электрическая резистентность является интегральным общим показателем множества процессов, происходящих в мембране, поэтому причина изменений резистентности эритроцитов этим способом не выявляется.

Из известных способов наиболее близким к предлагаемому является способ исследования активности метаболических процессов в клетке, включающий отбор крови, выделение форменных элементов крови, приготовление на их основе биологических проб, инкубацию биологических проб, определение показателей метаболизма в них, расчет информативного параметра активности метаболических процессов, в качестве которого используют соотношение показателей метаболизма, и сравнение информативного параметра с соответствующим параметром в норме. В этом способе в качестве крови используют венозную кровь в объеме 2-3 мл, в качестве форменных элементов крови лейкоциты. В качестве показателей метаболизма используют концентрации внутриклеточной и плазменной аминокислот, в качестве информативного параметра соотношение этих концентраций. При этом из венозной крови отмывают и выделяют лейкоциты, выделяют гранулоциты, измеряют количество внутри- и внеклеточной жидкости, переинкубируют клетки и подвергают их тридцати минутному ультрафиолетовому облучению, инкубируют три пробы (10, 20 и 30 мин), добавляют изотопы, измеряют концентрацию внутриклеточной и плазменной аминокислот и по их взаимосвязи судят о клеточном метаболизме организма.

Этот способ громоздок, требует значительного количества венозной крови, не дает полной информации об активности метаболических процессов в клетке, не позволяет выявить характер изменений клеточной адаптации.

Задача, на решение которой направлено изобретение, состоит в создании эффективного способа исследования метаболических процессов в клетке, лишенного указанных недостатков, свойственных способу-прототипу. Технический результат, который дает осуществление изобретения, заключается в расширении информативности способа за счет выявления характера изменения клеточной адаптации и создании более комфортных условий (щадящих условий) для организма при отборе крови.

Это достигается тем, что в способе исследования активности метаболических процессов в клетке, включающем отбор крови, выделение форменных элементов крови, приготовление на их основе биологических проб, определение показателей метаболизма в них, расчет информативного параметра активности метаболических процессов, в качестве которого используют соотношение показателей метаболизма, и сравнение информативного параметра с соответствующим параметром в норме, дополнительно приготавливают неинкубируемые биологические пробы, в качестве крови используют периферическую кровь с объеме 0,3-0,4 мл, в качестве форменных элементов крови эритроциты, в качестве показателей метаболизма гемолиз эритроцитов, количество общего и связанного малонового альдегида и интенсивность деградации малонового альдегида, в качестве информативного параметра систему отношений
МА₃/МА₁
МА₂/МА₁
МА₂/Г₂
Д/МА₁
Г₂/Г₁ где МА₁, МА₂ количество общего малонового альдегида в неинкубируемой и инкубированной пробах соответственно, нМоль/10⁹ эритроцитов;
МА₃ количество связанного малонового альдегида, нМоль/10⁹ эритроцитов;
Г₁,Г₂ гемолиз эритроцитов в неинкубируемой и инкубированной пробах соответственно,
Д интенсивность деградации малонового альдегида в инкубированной пробе,
Новым в изобретении является дополнительное приготовление неинкубируемых биологических проб, выбор вида и объема крови, выбор форменных элементов крови, показателей метаболизма и информативного параметра. Технический результат, обеспечиваемый изобретением, достигается всей совокупностью существенных признаков.

На фиг. 1 показана диаграмма, характеризующая основные этапы предлагаемого способа; на фиг.2 диаграмма, характеризующая наиболее часто встречающиеся варианты изменений мембранного метаболизма (I-VII типы); на фиг.3 диаграмма, характеризующая изменения нарушений мембранного метаболизма в эритроцитах недоношенных детей с перинатальным поражением центральной нервной системы и клинический прогноз.

Интенсивность мембранного метаболизма постоянно меняется в зависимости от изменения окружающей среды (меняется вязкость мембран, их липидный состав, скорость метаболизма жирных кислот, окислительная и антиокислительная активность и т.д.). Наиболее подходящими для определения клеточной адаптации являются степень гемолиза эритроцитов и ее изменение после инкубации клеток в физиологических условиях, содержание метаболита ненасыщенных жирных кислот малонового альдегида до и после инкубации клеток, содержание его связанной фракции, способность клеток деградировать малоновый альдегид. Интенсивность синтеза и распада образующегося метаболита, способность клетки избавляться от него и связывать его адекватно реагируют на изменения среды, поэтому по ним можно объективно оценивать состояние клеточных мембран. Поскольку мембраны клеток способны к исключительно быстрой перестройке своего метаболизма, особенно липидного бислоя, в ответ на энергетические и информационные воздействия внешней среды, по состоянию клеточной адаптации можно однозначно судить об уровне здоровья и эффективности терапии. При этом можно выделить четыре уровня адаптации (в классификации):
1 состояние удовлетворительной адаптации к условиям окружающей среды и достаточных функциональных возможностей организма. Это состояние относится к типу I изменений мембранного метаболизма (фиг.2) является "комфортным" и характеризует норму.

2 состояние напряжения адаптационных механизмов, когда гомеостаз поддерживается благодаря определенному напряжению регуляторных систем. Это состояние также относится к норме и характеризует типы II и III изменений мембранного метаболизма. Организм при этом находится в состоянии стресса или сразу после стресса.

3 состояние неудовлетворительной адаптации к окружающей среде, когда гомеостаз сохраняется благодаря включению компенсаторных механизмов. Это состояние начала болезни, при котором наряду с напряжением компенсаторных механизмов наблюдаются первые элементы нарушения (тип IV).

4 адаптация в условиях болезни (срыв механизмов приспособления). Этому уровню адаптации соответствуют типы V, VI и VII изменений мембранного метаболизма.

Вся система адаптации, включая гормональную, серотониновую, систему ренин-ангиотензин, простогландиновую и др. направлена на восстановление и поддержание правильной работы клетки и ее мембраны, действуя через нее на организм в целом. Исследуя мембранный метаболизм, т.е. анализируя соотношения показателей метаболизма, можно объективно выявить совокупный ответ своей адаптационной системы организма, например на фармакологический препарат или физиотерапевтическое воздействие. Положительные изменения в мембранном метаболизме в результате лечения являются подтверждением положительного эффекта применяемой к данному больному терапии. Исследуя мембранный метаболизм до назначения терапии, можно выбрать препарат, наиболее подходящий для коррекции выявленных нарушений. Следует подчеркнуть, что система отношений показателей метаболизма МА₃/МА₁, МА₂/МА₁, МА₂/Г₂, Д/МА₁, Г₂/Г₁ наиболее информативна для определения состояния клеточной адаптации, поскольку все показатели метаболизма взаимосвязаны между собой. Использование при исследовании активности метаболических процессов в клетке периферической крови обусловлено тем, что эта кровь несет информацию о состоянии организма в целом, а не какого-то отдельного органа. Эритроциты этой крови, наряду с доступностью и удобством работы с ними, несут информацию и о других клетках. Как установлено экспериментально, для определения указанных выше показателей метаболизма необходимо не менее 0,3 мл периферической крови. Величина 0,4 мл является достаточным уровнем. Малый объем требуемой крови создает щадящий режим для организма при отборе крови, позволяет проводить исследования периодически во время лечения, применяя индивидуальный курс выбранного препарата.

Предлагаемый способ реализуется следующим образом (фиг.1).

Берут 3-4 капли периферической кpови в пробирку с 4-5 мл физраствора с цитратом натрия. Отмывают эритроциты физраствором, приготавливают 5%-ную взвесь эритроцитов. В четыре центрифужные пробирки добавляют по 400 мкл 5% -ной взвеси эритроцитов и 450 мкл трис-НСl буфера. В четвертую пробирку добавляют 10 мкл синтезированного из 1,1,3,3-тетраметоксинпропана малонового альдегида. Первую биологическую пробу центрифугируют. Во вторую биологическую пробу добавляют 100 мкл 20% трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и центрифугируют в тех же условиях. Третью биологическую пробу инкубируют 10 мин, после чего также центрифугируют. Четвертую биологическую пробу инкубируют при той же температуре 2-3 мин, а затем добавляют 500 мкл 20% ТХУ. В первой и третьей биологических пробах в надосадочной жидкости определяют степень гемолиза эритроцитов по выходу гемоглобина в них, используя спектрофотометр, например, СФ-26, после чего в первую биологическую пробу добавляют 10 мкл 0,1% -ного сапонина для получения полного гемолиза. Степень гемолиза в этих пробах вычисляют в процентах от экстинкции полного гемолиза. Из второй биологической пробы удаляют надосадочную жидкость и добавляют туда 800 мкл буфера. Затем в первую, вторую и третью биологические пробы добавляют 500 мкл ТХУ, во все четыре биологические пробы вносят по 150 мкл 5 н НСl и 600 мкл 0,67% тиобарбитуровой кислоты. Параллельно готовят две контрольные пробы, в которые добавляют по 850 мкл буфера (во вторую 10 мкл малонового альдегида) и те же реактивы, что и в рабочие биологические пробы. После выдержки в бане все биологические пробы центрифугируют и в надосадочной жидкости определяют экстинкцию на спектрофотометре при длинах волн 532 и 600 нм. Экстинкцию при 600 нм вычитают из экстинкции при 532 нм и получают результат в нМоль/10⁹ эр. применяя молярный коэффициент (1,56˙10⁵ М^-1см^-1).

Пример наиболее часто встречающихся типов изменений мембранного метаболизма, выявленных на основе исследования метаболических процессов с помощью анализа изменений соотношений показателей, показан на фиг.2. Выявлено семь основных типов изменений мембранного метаболизма. Их них три типа характеризуют норму, а четыре встречаются при патологии:
I тип. Он определяется в том случае, когда величины параметров находятся на низкой границе нормы, а их соотношения Г₂/Г₁, МА₂/МА₁, МА₂/Г₂ и Д/МА₁ на высокой границе нормы. Это бывает в состоянии покоя, сразу после пробуждения и характеризует "комфортное" состояние клетки.

II тип. При эмоциональном, физическом и другом остром напряжении интенсивность синтеза малонового альдегида повышается, однако содержание МА₁ может быть как выше, ниже, так и в пределах нормы в зависимости от интенсивности деградации Д. Повышение перекисного окисления липидов характеризуется резким повышением прироста гемолиза за время инкубации (Г₂/Г₁) до 200-400% сниженной величиной МА₃, повышенным приростом малонового альдегида (МА₂/МА₁) и низкой величиной МА₂/Г₂. Такое изменение мембранного метаболизма не является нарушением адаптации и характеризует удовлетворительное приспособление клетки к стрессу.

III тип. По окончании напряжения, если стресс не был длительным, имеет место снижение активности перекисного окисления липидов без снижения деградации Д. При этом прирост малонового альдегида имеет отрицательную величину, что свидетельствует о преобладании процессов деградации малонового альдегида над синтезом, а также о недостатке ненасыщенных фосфолипидов, потраченных в результате работы клетки в условиях стресса. МА₃ здесь находится в пределах или выше нормы. Через некоторое время (несколько часов или дней с зависимости от силы стресса) активность мембранного метаболизма переходит в тип I.

IV тип. При чрезмерных стрессовых ситуациях (длительных эмоциональных, физических и других перегрузках, а также в острой стадии инфекционной или соматической болезни) активность мембранного метаболизма нарушается. Этот тип характеризуется увеличением прироста гемолиза и перекисного окисления липидов с элементами нарушения увеличивается соотношение МА₂/Г₂, снижается прирост малонового альдегида и повышается МА₃, снижается Д и Д/МА₁. Такой тип часто встречается при хронизации процесса, переходе из острого в хроническое течение болезни. В этом случае в результате нарушения внутренних взаимосвязей между параметрами, изменения перекисного окисления липидов не приводят к соответствующим изменениям МА₃ и Д, что создает условия для накопления малонового альдегида в клетке.

V тип. При накоплении в клетке малонового альдегида происходит угнетение перекисного окисления липидов этим продуктом, что сопровождается снижением прироста гемолиза, повышением Г₁ и МА₃, снижением Д. Такое состояние мембранного метаболизма наблюдается при хронических заболеваниях печени, почек, желудочно-кишечного тракта, при длительных бытовых перенапряжениях.

VI тип. Чрезмерное напряжение может закончиться угнетением перекисного окисления липидов в результате истощения его субстрата, что сопровождается снижением прироста гемолиза и малонового альдегида, уменьшением МА₁ и часто Г₁, тогда как Д и Д/МА₁ могут быть в пределах нормы или даже повышены. Такой тип встречается при затяжных пневмониях, ишемической болезни сердца, в период после инфаркта миокарда, после затяжного гриппа и длительного эмоционального или физического напряжения.

VII тип. Этот типа характеризуется различным сочетанием признаков, которые можно оценить как разбалансировку метаболических процессов. Так, встречается повышение перекисного окисления липидов при повышении МА₂/Г₂, МА₃, снижении прироста малонового альдегида. Встречаются и завышенные величины МА₂/МА₁ и заниженные величины МА₃ при угнетении перекисного окисления липидов, что позволяет предполагать возможную дезорганизацию и разрыхление внутреннего слоя клеточной мембраны, нарушение межмолекулярных связей, подобных иммунным. Заключение по этому типу дается в зависимости от конкретных нарушений клеточной адаптации.

Помимо основных, главных типов изменений мембранного метаболизма, могут быть и иные, что связано с индивидуальными особенностями каждого человека (и его клетки) адаптироваться при изменении внешней и внутренней среды.

Пример изменения мембранного метаболизма у недоношенных детей с перинатальным поражением мозга по мере их развития и соматическое состояние таких детей иллюстрируется фиг. 3. Здесь отображены данные, полученные у недоношенных и доношенных новорожденных с перинатальным поражением мозга с момента рождения и до 20-25 дней жизни. Повышение активности мембранного метаболизма по типу II или IV характерно для плода в результате влияния матери на плод при патологии беременности и для новорожденных с перинатальным поражением мозга первых часов и суток жизни. Однако уже через несколько дней может наступить угнетение перекисного окисления липидов по типу V (с повышением содержания малонового альдегида, уменьшением Д и Д/МА₁, повышением МА₂/МА₁) или по типу VI (со снижением содержания МА₁, истощением субстрата перекисного окисления липидов без изменения или с повышением Д). Угнетение мембранного метаболизма по типу V, при котором происходит снижение интенсивности фосфолипидного обмена (и, как следствие, миелинизации мозга) ведет к хронизации патологического процесса. Это сопровождается замедлением темпов роста ребенка, его развития и приводит, в частности, к церебральному параличу. Назначение витамина Д, препаратов железа, кислородотерапия могут предотвратить хронизацию процесса, так как имеют прооксидантный характер. Угнетение мембранного метаболизма по типу VI, при котором происходит истощение ненасыщенных фосфолипидов, может привести к разрыхлению и дезорганизации липидного бислоя, к большей доступности фосфолипидов внутреннего слоя к перекисному окислению липидов. Следствием этого может быть разрушение мембран, демиелинизация мозга и др. VII тип, обнаруженный у детей с перинатальным поражением мозга, к 20-25 дням жизни неизменно сопровождается тяжелым соматическим состоянием, глубокими нарушениями центральной нервной системы.

П р и м е р. Проведено исследование активности метаболических процессов в клетке у больного Позднякова П.Г. 46 лет, страдающего ишемической болезнью сердца. Полученные показатели метаболизма, их соотношения и нормальные величины параметров сведены в таблицу. Измеренные значения показателей и их соотношения статистически значимы. Из данных таблицы видно, что клеточная адаптация снижена и относится к четвертому уровню адаптации в условиях болезни, что соответствует типу V изменений мембранного метаболизма. Повышение Г₁ косвенно свидетельствует об увеличении вязкости клеточной мембраны. Перекисное окисление липидов снижено. Уменьшение Д и Д/МА₁ является возможной причиной задержки МА₁ в клетке. Увеличение связанного малонового альдегида МА₃ также указывает на угнетение перекисного окисления липидов. Повышение Г₁ и МА₁ свидетельствует о "зашлакованности" клетки, т.е. повышенном содержании метаболитов в ней, что снижает функциональные возможности клеточной мембраны. Поэтому больному могут быть рекомендованы прооксиданты и препараты, содержащие ненасыщенные фосфолипиды, например, эссенциале.

Способ, реализуемый в соответствии с изобретением, существенно проще по сравнению с известными аналогичными способами, он занимает 2,5-3 ч, обеспечивая получение достоверной информации об активности метаболических процессов в клетке. Он обладает широкой информативностью за счет выявления характера изменения клеточной адаптации и одновременно высокой чувствительностью. Способ требует всего 0,3-0,4 мл крови, взятой, например, из пальца, что обеспечивает щадящие условия при отборе крови.

Использование: в медицине, биохимии крови, для оценки активности метаболических процессов в клетке. Технический результат заключается в расширении информативности способа за счет выявления характера клеточной адаптации, повышении достоверности и упрощении способа, а также в создании щадящих условий для организма при отборе пробы крови. Сущность изобретения: дополнительно приготавливают неинкубируемые биологические пробы, в качестве исследуемого материала используют периферическую кровь в объеме 0,3 0,4 мл и эритроциты. Регистрируют уровень гемолиза эритроцитов, уровни общего и связанного малонового альдегида и интенсивность деградации последнего. Рассчитывают информативный показатель, представляющий собой систему из шести отношений показателей метаболизма. 3 ил. 1 табл.

СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ АКТИВНОСТИ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В КЛЕТКЕ, включающий отбор крови, выделение форменных элементов крови, приготовление на их основе биологических проб, инкубацию биологических проб, определение показателей метаболизма в них, расчет информативного параметра активности метаболических процессов, в качестве которого используют соотношение показателей метаболизма и сравнение информативного параметра с соответствующим параметром в норме, отличающийся тем, что дополнительно приготавливают неинкубируемые биологические пробы, исследуют периферическую кровь в объеме 0,3 0,4 мкл, в качестве форменных элементов крови используют эритроциты, а в качестве показателей метаболизма гемолиз эритроцитов, количество общего и связанного малонового альдегида и интенсивность деградации малонового альдегида, в качестве информативного параметра систему отношений
МА₃/МА₁, МА₂/МА₁, МА₂/Г₂, Д/МА₁, Г₂/Г₁,
где МА₁, МА₂ количество общего малонового альдегида в неинкубируемой и инкубированной пробах соответственно, нмоль/10⁹ эритроцитов;
МА₃ количество связанного малонового альдегида, нмоль/10⁹ эритроцитов;
Г₁, Г₂ гемолиз эритроцитов в неинкубируемой и инкубированной пробах соответственно,
Д интенсивность деградации малонового альдегида в инкубированной пробе,