Способ исследования метаболизма малонового диальдегида в эритроцитах Советский патент 1988 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биохимии и медицине и может быть использовано в диагностике мембранных нарушений у детей при различных патологических состояниях, сопровождающихся задержкой малонового диальдегида (МДА) в организме.

Цель изобретения - повышение информативности способа за счет дополнительного определения степени деградации МДА.

Способ осуществляется следующим образом.

10

пробы эритроцитов: 400 мкл 5%-й взве си эритро1Д1тоз +450 мкл трис-НС1 буфера и во вторую пробу добавляют 10 мкл экзогенного МДА (10 нМ), кото рый приготовлен путем гидролиза 1,1,3,3-тетраметоксипропана 0,1 н. НС1 3 мин при 40°С с последующей ней трализацией 0,1 н. NaOH, Такую же дозу МДА Добавляют в третью пробу, содержащую 850 мкл трис-НС1 буфера. Все три пробы инкубируют 3 мин при 37 С, затем добавляют 500 мкл 30% ТХУ, 150 мкл 5 н. НС1 и 600 мкл

Берут свежеприготовленный и перег-15 0,67%-й ТБК, ставят в баню при 98 С

нанный 1,1,3,3-тетраметоксипропан (1-5 мкмолей), гидролизуют О,1 N НС1 2-3 мин при 40 С с последующей нейтрализацией и разводят в трис-ИС1 буфере рН 7,4 до концентрации 10-15 нмолей в 20 мкл. Берут периферическую кровь (0,5 мл), трижды отмывают эритроциты физраствором, приготавливают 5%-ю взвесь эритроцитов и по 400 мкл вносят в параллельные пробы, в которые добавляют по 450 мкл трис-НС1 буфера. В контрольную пробу (без эритроцитов) вносят 850 мкл буфера. Б 1-ю пробу эритроцитов и в контрольную пробу вносят точно по 10 мкл свежеприготовленного МДА, а во 2-ю пробу - 10 мкл буфера. Все три пробы инкубируют не менее 1 мин при 37°С, после чего добавляют по 500 мкл 30%-ной трихлорук- сусной кислоты (ТХУ). Добавляют 150 мкл 5М НС1 и 600 мкл 0,67%-ной тиобарбитуровой кислоты (ТБК). Пробы ставят в баню при 100°С и после 40- 60 мин в прозрачном центрифугате определяют оптическую плотность, а за- тем количество МДА. во всех трех пробах на при длине волны 532 им. Степень деградации определяют после вычитания количества МДА во второй пробе из первой пробы и выражают в % от контрольной пробы. При этом ответ в % дeгpaдauд) более точен, чем в нМ, поскольку возможны некоторые неточности в приготовлении новых доз МДА. Процент деградации ГЩА не меняется при добавлении в пробы эритроцитов МДА в к6л:ич:естве 5-20 нМ.

Пример . Берут 3 капли периферической крови, эритроциты трижды отмывают физраствором, готовят 5%-ю взвесь эритроцитов в трис-НС1 буфере с добавлением КС1 (50 мкл Ёзвёси эритроцитов 950 мкл буфера), готовят две

пробы эритроцитов: 400 мкл 5%-й взвеси эритро1Д1тоз +450 мкл трис-НС1 буфера и во вторую пробу добавляют 10 мкл экзогенного МДА (10 нМ), который приготовлен путем гидролиза 1,1,3,3-тетраметоксипропана 0,1 н. НС1 3 мин при 40°С с последующей нейтрализацией 0,1 н. NaOH, Такую же дозу МДА Добавляют в третью пробу, содержащую 850 мкл трис-НС1 буфера. Все три пробы инкубируют 3 мин при 37 С, затем добавляют 500 мкл 30% ТХУ, 150 мкл 5 н. НС1 и 600 мкл

5

0

0 5 0 5 0

на 20 мин, центрифугируют при 3000 об,/мин 15 мин и надосадочную жидкость спектрофотометрируют (в микроватах) при двух длинах волн: 532 и 600 на отечественном спектрофотометре СФ-26. Степень деградации МДА определяют путем вычитания экстинции второй пробы из первой и деления на экстинцию третьей пробы, умножая на 100 для получения ответа в процентах. I

Б табл. 1 представлены конкретные примеры определения степени деградации МДА эритроцитами.

В табл. 2 представлены данные о степени деградации МДА в эритроцитах у здоровых детей разного возраста, взрослых и при некоторых патологических состояниях у детей.

Формула изобретения

/

Способ исследования метаболизма малонового диальдегида в эритроцитах путем исследования опытной пробы, содержащей эритроциты, и контрольной, .не содержащей эритроцитов пробы, до- бавлейия в пробы трихлоруксусной кислоты, соляной кислоты и тиобарбитуровой кислоты с последующим нагреванием проб, охлаждением и спектрофотомегриро- ванием, отличающийся тем, что, с целью повьшге шя информативности способа за счет дополнительного определения степени деградации малонового диальдегида, готовят две пробы, содержащие эритроциты, в одну из них и в пробу, не содержащую эрит- РО1ЩТОВ, добавляют малоновьй диаль- дегид, инкубируют пробы не менее .1 мин, а степень деградации малонового диальдегида определяют как разность оптических плотностей в пробах с эритроцитами, содержащей и не содержащей добавленный малоновьй диальдегид, деленную на оптическую плотность пробы, не содержащей эритроцитов.

Таблица 1

Изобретение относится к биохимии и медицине, предназначено для диагностики мембранных нарушений у детей при патологических состояниях, сопровождающихся задержкой малонового диальдегида (МДЛ) в организме. Цель изобретения - повышение информативности способа. Для этого 1, 1,3,3-тетраметоксипропан (1- - 5 мкмолей) гидролизуют О,1N НС1 2-3 мин при 40°С, нейтрализуют и разводят в трис-НС1 буфере, рН 7,4 до конц. 10-15 ммолей в 20 мкл. В пробе периферической крови (0,5 мл) трижды отмывают эритроциты физраствором, готовят взвесь эритроцитов и по 400 мкл вносят в параллельные пробы, добавляя по 450 мкл трис-НС1 буфера. В контроль (без эритроцитов) вносят 850 мкл буфера. В 1-ю пробу и в контроль вносят по 10 мкл свежеприготовленного МДА, во 2-ю пробу - 10 мкл ; буфера. Все три пробы инкубируют 1 мин при 37°С, добавляют по 500 мкл 30%-ной трихлоруксусной кислоты, 150 мкл 5М НС1, 600 мкл 0,67%-ной тиобар- битуровой кислоты. Пробы ставят в баню при 100°С на 40-60 мин, затем в про- зрачном центрифугате определяют оптическую плотность и кол-во МДА во всех 3-х пробах на СФ-26 при -532 км. :Степень деградации МДА определяют после вьмитания кол-ва МДА во пробе из 1-й пробы и выражают в % от контрольной пробы. % деградации более точен, чем нм, т.к. не меняется при добавлении в пробы эритроцитов МДА в количестве 5-20 нм. 2 табл. СО со 00 00 00

Новорожденные дети 3-5, дней жизни,

п 12

Дети 6 лет, п 14

Дети 14-16 лет, п 6 Взрослые люди 35-65 лет, п 6

16,35 +1,76 32,27 + 1,48

Новорожденные с нарушением мозгового кровообращения, п 89,65 + 0,67 Дети 5-6 лет с церебральньм параличом, п 10 26,3 + 1,32