Способ очистки суспензии эритроцитов от холестерина Советский патент 1991 года по МПК G01N33/92 

(21) лбг,1 736/14 С2) 0°,01 .,п,9 46) 30.04,91 . Бкп. У 16 t,7) t av4HO-Hce.ne,aoBaTej bCKHft институт пе,ы атрии АМН СССР и Московский чнс 1 игу тонкой химической технологии им, М.3.Ломоносов ч (/2) В.З.Банкова, И.Ц.Ходжаеза, М.И.Бтканов, Ю.А.Зот.а,, И.В.Кислова и Н. Й.Кислшговская (33) 612.015 (038.3) (56) Вопросы . 1932, if 6, с. 131-133.

(54) СПОСОБ ОЧНГТлТ СУСПРЧ ПШ РИТ- РОШ1ТОЗ пт ХОЛЕСТЕРИНА f57) Изобретение относится к медииине и может быть использовано для очистки эритроцитов от холестерина и МДА. Целью изобретения является повышение физиологичное™ способа. Цель достигается применением известного вещества, латекса,используемого в резиновой промышленности в качестве сорбента малонового диальдегида, и холестерина из эритроцитов. Для этого готовят взвесь латекса в трис-HCl буфере (рН 7,4) в концентрации 0,5-1,0% и инкубируют отмытые эритроциты 30-40 мин в соотношении 1:1 с латексом с добавлением буфера или без него при непосредственном контакте с латексом. 4 табл.

г

(Л

Изобретение относится с медицине, а именно к способам очистки эритроцитов.

Цель изобретения - повышение фи- зиолот ичности способа за счет сохранения натийных свойств клегок.

Пример 1. К 200 мкл уплотнённой взвеси эритроцитов,добавляют 500 мкл буфера и 200 мкл 0,5-1,0%-но- го латекса. 3 контрольные пробы (без латекса) добавляют 700 мкл трис- НС1 буфера. Пробы инкубируют 30 мин при 37°С, затем пробы эритроцитов промывают 3-4 раза физраствором (до полного отмывания от латекса).В 5% взвеси эритроцитов в буферной среде определяют содержание МДА : 400 мкл взвеси + 450 мкл буфера + 500 мкл 20%-ной трихлоруксусной кислоты . 150 мкл 5н. НС1 600 мкл 0,67%- ной тиобарбитуровой кислоты,добавляют в центрифужные пробирки,встряхивают и ставят в баню 93-99 С. Через 20-30 мин пробы центрифугируют и в надосадочной жидкости определяют ко- личество МДА на спектрофотометре СФ-26 при 532 и 600 нм. Содержание холестерина определяют ферментативным методом по наборам Lab.systems (Финляндия) . Конъюгированные гидроперекиси определяют по УФ-свечению (233 нм) гептанового слоя их экстракта из эритроцитов. Интенсивность деградации МДА определяют по проценту разрушения введенного в пробу эритроцитов экзогенного МДА, В ,рольных пробах (без латекса) содержание МДА и ХЛ составляет соответственно 2,23 и 29,12 нмоль/10 эр, а .после экспозиции с латексом их содер- 1 жание уменьшилось соответственно до 1,60 и 19,12 нмоль/10 эр (см.табл.О,

0 СП

ос со со

Пример2. К 200 мкл уплотненной взвеси эритроцитов добавляют 200 мкл 1%-ного свежеприготовленно- Vo латекса, встряхивают и инкубируют при 30 мин. Контрольную пробу инкубируют с 200 мкл буфера.атем эритроциты центрифугируют, отделяют надосадочную жидкость, 3-4 раза промывают физраствором и определяют содержание в контрольной и опытной пробах МДА и ХЛ. Содержание этих веществ в контрольной пробе составило соответственно l,19iO,15 и 23.08± + 3,48 нмоль/JO эр, а после экспозиции с латексом 0,76+0,11 нмоль/ /106 эр (,05) и 15,43+2,20 нмоль /10 эр (п 8). Как и в первом варианте, низкие значения МДА и УЛ латекс не изменял.

Таким образом, экспозиция с латексом эритроцитов как с буферной,так и без буферной средой приводит к удалению из клеток красной крови МДА и ХЛ, повышенное количество которых приводит к повышению вязкости,жесткости мембран, снижает активность многих мембранных ферментов, ухудшает структурно-функциональное состояние клеточной мембраны. Не меняется после инкубации с латексом деформационный индекс эритроцитов, определенный по степени фильтрации эритроцитов через мембранный фильтр sin рог (без латекса деформационный индекс эритроцитов 0,l9l±0,12, а после экспозиции с латексом 0,230iQ,020), не изменяется и степень гемолиза эритроцитов, определенная по выходу гемоглобина. Эти данные вместе с уменьшением содержания ХЛ и МДА указывают на улучшение реологических свойств эритроцитов и структурно-функционального состояния клеточной мембраны, 60%-ный натуральный латекс, содержащий аммиак, разводят в буферной среде (трис-HCl буфер, ,4, 25 мМ, разведенный 1:1 физраствором с добав лением 0,175 М КС1) до концентрации 0,5-1,0%. Другие концентрации латекса оказались менее эффективными: 0,1%-ный латекс не оказывает существенного влияния на содержание МДА и ХЛ в эритроцитах, а 5-10%-ный латекс способствует склеиванию эритроцитов. Таким образом, наиболее физиологическая и активная концентрация

5

0

5

0

5

0

5

0

5

латекса, используемого в качестве сорбента, является 0,5 - 1,0%. В качестве биологического материала использовались отмытые в физрастворе эритроциты.

В табл.1 показано влияние двух разведений латекса на показатели в эритроцитах.

Как видно из табл.1, содержание МДА и ХЛ уменьшается в эритроцитах только при инкубации их с 0,5 1,0%-ным раствором латекса. При этом существенно не меняется содержание гидроперекисей. Интенсивность деградации МДА,которая в основном зависит от активности альдегиддегид- рогеназы, также не меняется. Это позволяет полагать, что МДА из клеток красной крови удаляется путем адсорбции, а не повышением активности его ферментативного разрушения.

При индивидуальном разборе материала выявлено, что МДА и ХЛ наиболее эффективно удаляются в случае повышенного их содержания в эритроцитах, тогда как при нормальном содержании этих продуктов инкубации с латексом не приводит к их изменению (см. табл.2).

В табл. 3 и 4 приведены факты повышения физиологичности способа.

Латекс адсорбирует только холестерин, но не фосфолипиды, что значительно снижает повышенное соотношение холестерин/фосфолипиды, В отличие от латекса дигитониновый сорбент (прототип) удаляет и фосфолипиды ( в два раза меньше,чем холестерина), а активированный уголь в равных количествах адсорбирует эти два вещества.

Формула изобретения Способ очистки суспензии эритроцитов от холестерина путем обработки суспензии сорбентом, о т л и ч а ю- щ и и с я тем, что, с целью повышения физиологичности способа за счет сохранения нативных свойств клеток, а также возможности одновременной очистки от малонового альдегида, в качестве сорбента исполь зуют натуральный латекс, при этом взвесь эритроцитов смешивают с 0,5-1,0%-ным латексом в соотношении 1:1, инкубируют смесь 30 мин, а затем отмывают эритроцшы физиологическим раствором.

Таблица 1

Сорбция латексом малонового диальдегида и холестерина

Различие достоверно с покатагепями в пробах эритроцитов, не инкубированных с латексом, Р 0,05.

Таблица2

Зависимость сорбции латексом МДА и ХЛ от исходного содержания этих метаболитов в эритроцитах

п 10

2,4S±0,3I 1,47±0,20 ,05

п 6

1,10+0,14 1,32+0,19

п 7

36,12+2,62 22,50±3,12 Р 0,01

п 6 20,33+3,Зв 18,33±1,75

Т а б л и ц л 3

Изменение содержания хочесгерина,фосфолипидов и индекса ХС-ФЛ в эритроцитах детей после инкубации с натуральным латексом

Примечание: 1

II инкубация эритроцитов без латекса; инкубация эритроцитов с латексом.

Т а б л и ц а 4

Содержанж матпюжтио диальдегида, холестерина и фосфолипидо н латексе (1%) после инкубации с эпигропигами (п 4-8)

0,11+0,005 1,72+0,25

0,195±0,040 1,7Ч±0,035

Равно 0,05 Нет различий