СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВА Российский патент 1994 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области биохимии, а более конкретно - к определению биологической активности (БА) веществ. Областью его применения являются преимущественно фармакология, медицина, экология, производство продуктов питания. Оно может использоваться для определения БА фармакологических средств, пленок медицинского назначения, продуктов питания, питательных смесей, фитонапитков, примесей в питьевой воде, различных органических и неорганических веществ и материалов.

Известны способы определения БА веществ, основанные на введении животному испытуемого вещества и наблюдении за изменениями у него обменных процессов, например липидного обмена [1] .

При этом дополнительно у животного может вызываться воспалительный процесс, например введением четыреххлористого углерода, что резко увеличивает мембранный метаболизм, в частности перекисное окисление липидов [2] .

Эти способы позволяют определить БА вещества по реакции живого организма в целом, которая состоит как из непосредственного действия биологически активного вещества на клеточные мембраны, так и опосредованного действия на них через другие системы организма. Это не позволяет определить прямое действие биологически активных веществ на клетку. Недостатком этих способов является и необходимость использования для их реализации животных.

Известен способ определения БА веществ (витамина Е в сочетании с витамином A), представляющий собой метод исследования БА в модельных условиях с заданными параметрами, основанный на определении влияния испытуемого вещества (витамина) на перекисное окисление лецитина (аскорбат-зависимое) в суспензии липосом [3] .

При этом способе потенциальная возможность проявления БА вещества уменьшена, поскольку БА исследуется при определенных заданных условиях повышения перекисного окисления липидов (ПОЛ). Кроме того, модельная система не обеспечивает полной объективности результатов, поскольку в такой системе нет многих составляющих биологической клеточной мембраны, т. е. этот способ не дает результата, полно свидетельствующего об изменении мембранного метаболизма и системы адаптации, так как в нем изучается влияние биологически активного вещества только на образование метаболита ПОЛ - малонового альдегида и не исследуется влияние биологически активного вещества на способность клетки деградировать малоновый альдегид, на антиокислительную активность и др.

Известен способ определения БА веществ, например, биологических жидкостей и реагентов, при котором определяют их антиокислительную активность [4] . Для определения антиокислительной активности биологической жидкости используют ее способность окислять SH-группы, присутствующие в растворимых белках хрусталика глаза млекопитающих.

Этот способ сложен, так как он требует выделения, гомогенизации и очистки хрусталика глаза. Кроме того, этот способ малоинформативен, поскольку он позволяет определить БА веществ только в отношении антиокислительной активности. Он не позволяет выявить влияние биологически активного вещества на метаболизм малонового альдегида. Способ требует забоя животного.

Из известных способов наиболее близким к заявленному по совокупности признаков является способ определения биологической активности веществ, включающий приготовление контрольного и рабочего биологических препаратов клеточной субстанции животного организма, добавление испытуемого вещества в рабочий биологический препарат, инкубацию контрольного и рабочего биологических препаратов, определение в них показателей метаболизма, в качестве одного из которых используют содержание в биологическом препарате малонового альдегида, сравнение показателей метаболизма в контрольном и рабочем биологических препаратах и суждение о степени биологической активности испытуемого вещества по величине показателей метаболизма [5] .

Определение БА веществ при этом способе основано на влиянии биологически активного вещества на показатели метаболизма в микросомах печени взрослых крыс "ин витро". При этом вначале приготавливают микросомы печени и хранят их при отрицательной температуре (- 18^оС) до использования, т. е. в качестве клеточной субстанции используют замороженные микросомы печени. Рабочий биологический препарат получают добавлением в него испытуемого вещества. После инкубации контрольного и рабочего биологических препаратов в среде с перекисью водорода определяют в них содержание малонового альдегида, продукцию пентана и этана и уровень хемилюминесценции.

Этот способ недостаточно информативен, имеет недостаточно высокую достоверность и сложен. Для осуществления способа необходимо использовать животных и забивать их. Выделение микросом печени (по сравнению, например, с выделением эритроцитов) представляет собой сложный и длительный процесс. Кроме того, используются микросомы с заранее заданной интенсивностью мембранного метаболизма (условия активации ПОЛ), что сужает возможность проявления БА. Все показатели способа характеризуют активность ПОЛ, который является лишь одной из составляющих мембранного метаболизма.

Задача, на решение которой направлено изобретение, состоит в создании высокоэффективного способа определения БА веществ, лишенного недостатков, свойственных прототипу. Технический результат заключается в расширении информативности способа за счет выявления характера БА вещества, повышении достоверности и упрощении способа.

Это достигается тем, что при способе определения БА веществ, включающем приготовление контрольного и рабочего биологических препаратов клеточной субстанции живого организма, добавление испытуемого вещества в рабочий биологический препарат, инкубацию контрольного и рабочего биологических препаратов, определение в них показателей метаболизма, в качестве одного из которых используют содержание в биологическом препарате малонового альдегида, сравнение показателей метаболизма в контрольном и рабочем биологических препаратах и суждение о степени биологической активности испытуемого вещества по величине изменений показателей метаболизма, в качестве клеточной субстанции биологических препаратов используют свежеприготовленные эритроциты, в качестве показателей метаболизма дополнительно используют степень гемолиза эритроцитов, интенсивность деградации малонового альдегида и антиокислительную активность, а после определения показателей метаболизма в контрольном и рабочем биологических препаратах рассчитывают соотношения
МА_р/Г_р, МА_к/Г_к, Д_р/МА_р, Д_к/МА_к, АОА_р/МА_р, АОА_к/МА_к, где МА_к, МА_р - содержание малонового альдегида в контрольном и рабочем биологических препаратах соответственно;
Г_к, Г_р - степень гемолиза эритроцитов в контрольном и рабочем биологических препаратах соответственно;
Д_к, Д_р - интенсивность деградации малонового альдегида в контрольном и рабочем биологических препаратах соответственно;
АОА_к, АОА_р - антиокислительная активность в контрольном и рабочем биологических препаратах соответственно;
при этом делают вывод об отсутствии биологической активности у испытуемого вещества, если между величинами соответствующих показателей метаболизма и их соотношений в контрольном и рабочем биологических препаратах различий нет, о наличии у испытуемого вещества слабой биологической активности, если
Г_р - Г_к 0,
МА_р - МА_к 0,
Д_р - Д_к 0,
АОА_р - АОА_к 0,
МА_р/Г_р - МА_к/Г_к ≈ 0,
Д_р/МА_р - Д_к/МА_к ≈ 0,
АОА_р/МА_р - АОА_к/МА_к ≈ 0, о наличии у испытуемого вещества высокой биологической активности, инициирующей мембранный метаболизм, если
Г_р - Г_к > 0,
МА_р - МА_к > 0,
Д_р - Д_к > 0,
АОА_р - АОА_к > 0,
МА_р/Г_р - МА_к/Г_к < 0,
Д_р/МА_р - Д_к/МА_к > 0,
АОА_р/МА_р - АОА_к/МА_к > 0, о наличии у испытуемого вещества высокой биологической активности, угнетающей мембранный метаболизм, если
Г_р - Г_к < 0,
МА_р - МА_к < 0,
Д_р - Дк < 0,
АОА_р - АОА_к < 0,
МА_р/Г_р - МА_к/Г_к > 0,
Д_р/МА_р - Д_к/МА_к < 0,
АОА_р/МА_р - АОА_к/МА_к < 0, о наличии у испытуемого вещества токсической биологической активности, если изменения величин показателей метаболизма и их соотношений в контрольном и рабочем биологических препаратах имеют резкий несбалансированный характер.

Признаки, отличающие предложенный способ от прототипа, характеризуют выбор клеточной субстанции биологических препаратов, использование в качестве показателей метаболизма дополнительно перекисного гемолиза, интенсивности деградации малонового альдегида и антиокислительной активности, расчет соотношений соответствующих показателей метаболизма в контрольном и рабочем биологических препаратах, суждение о степени и характере БА по изменению всех указанных показателей метаболизма и их соотношений.

Указанный технический результат обеспечивается всей совокупностью существенных признаков.

Биологически активные вещества (например, витамины, гормоны, питательные смеси, анти- и проаксиданты, фитонапитки, полисолодовые экстракты и др. ) являются препаратами неспецифического действия, влияющими на систему адаптации живого организма. При любых заболеваниях организма нарушается прежде всего эта система, которая непосредственно связана с интенсивностью мембранного метаболизма. Поэтому исследование БА веществ по их влиянию на показатели мембранного метаболизма позволяет выявить их прямое действие на мембраны, определить характер БА и дозовую зависимость. Мембранный метаболизм объективно связан со способностью клетки к ПОЛ и наработке его метаболита, к дальнейшей деградации образованного метаболита и его задержке путем связывания в клетке. Это и определило в качестве показателей метаболизма помимо содержания малонового альдегида, являющегося основным метаболитом, выбор степени гемолиза, интенсивности деградации малонового альдегида и антиокислительной активности. При этом оценка изменений не только абсолютных значений самих показателей, но и их соотношений обеспечивает повышение информативности способа, позволяя выявить характер БА. Использование соотношений показателей в относительных единицах облегчает построение алгоритмической модели способа.

На фиг. 1 и 2 показаны примеры дозовой зависимости характера БА фармакологических препаратов феноксана и анфена соответственно; на фиг. 3 и 4 приведены диаграммы, поясняющие выявление гемосовместимости полиуретановых пленок "Витур Т" и "Биомер" соответственно.

Сущность способа поясняется следующей последовательностью операций. Приготавливают контрольный и рабочий биологические препараты в виде контрольной и нескольких рабочих проб 5% -ной взвеси свежих эритроцитов с добавлением в рабочие пробы различных доз испытуемого вещества. Например, может быть приготовлено три рабочие пробы с низкой (10^-15 М), средней (10^-10 М) и высокой (10^-7 М) дозами. Все пробы выполняют одинаковыми, например, объемом по 2 мл. Затем инкубируют все пробы 20-30 мин в физиологической среде: трис-HCl буфер, рН 7,4 с добавлением хлористого калия. В каждой пробе по интенсивности мембранного метаболизма определяют в эритроцитах показатели (параметры), характеризующие клеточную систему адаптации: содержание в эритроцитах общего (и связанного) малонового альдегида (МА), степень гемолиза эритроцитов (Г), интенсивность деградации малонового альдегида (Д), антиокислительную активность (АОА) по задержке выхода иода из иодистого калия при добавлении в пробы перекиси водорода. Дополнительно может определяться также и содержание свободных радикалов и концентрация диеновых конъюгатов. Интенсивность деградации малонового альдегида может определяться, например, при добавлении в пробы синтезированного из 1,1,3,3-тетраметоксипропана малонового альдегида.

По изменениям величин указанных показателей и их соотношений (МА, Г, Д, АОА, МА/Г, Д/МА, АОА/МА) во всех пробах с добавлением испытуемого вещества по сравнению с контрольной пробой судят о степени и характере БА. При этом отсутствие изменений этих величин свидетельствует об отсутствии БА у испытуемого вещества. Уменьшение величин Г и МА при повышении соотношения МА/Г указывает на угнетение ПОЛ. Уменьшение величин Д и особенно Д/МА свидетельствует о снижении способности клетки избавляться от метаболита. Уменьшение АОА и АОА/МА свидетельствует о снижении антиокислительной активности клетки. Изменение величин параметров в противоположную сторону предполагает и "противоположную" БА. Причем изменение только одного или двух показателей без изменения соотношений указывает на слабую БА испытуемого вещества. Изменения соотношений показателей свидетельствуют о более сильной БА, чем при изменении абсолютных значений одних показателей без изменения их соотношений.

Резкие разбалансированные изменения показателей и особенно их соотношений указывают на токсическое, нарушающее процессы адаптации (срыв адаптации на уровне клетки) действие биологически активного вещества. При этом испытуемое вещество на уровне целого организма имеет действие то же, что и на уровне клетки и ее мембраны. Таким образом, изобретение позволяет сделать объективные выводы о БА испытуемого вещества простым методом.

П р и м е р 1. Изучалась БА фармакологических препаратов - феноксана и анфена. Выявлено, что при низком исходном содержании малонового альдегида (МА), интенсивности его деградации (Д) и антиокислительной активности (АОА) в дозах 10^-8-10^-14 М, эти величины повышаются после экспозиции эритроцитов с этими препаратами. Причем соотношения МА/Г, Д/МА также меняются в сторону их нормализации. При высоких исходных значениях параметров экспозиция эритроцитов с этими препаратами приводит к снижению соответствующих параметров. Таким образом, феноксан и анфен обладают нормализующим действием на клеточные мембраны (при повышении МА снижают его, а при снижении - повышают). Однако их БА зависит не только от исходного состояния метаболических процессов в мембране, но и от дозы введенного препарата.

На фиг. 1 и 2 показаны относительные изменения соотношений МА/Г, Д/МА, АОА/МА в эритроцитах в зависимости от дозы препаратов, введенных в инкубационную среду, для феноксана и анфена соответственно. Например, как видно из фиг. 1, феноксан в дозе 10^-14 М дает резкое увеличение МА/Г (что указывает на уменьшение ПОЛ), уменьшение соотношения Д/МА (что обуславливает снижение способности клетки избавляться от метаболита) и снижение АОА/МА (антиокислительной защиты), т. е. приводит к общему угнетению метаболических процессов в клетке, а следовательно, к снижению клеточной адаптации. Доза 10^-11 М не ведет к существенным изменениям в соотношении параметров, а доза 10^-8 М вызывает увеличение Д/МА и АОА/МА и уменьшение МА/Г, что свидетельствует об активации мембранного метаболизма и клеточной адаптации. Анфен отличается от феноксана тем, что он вызывает обратный дозовый эффект лишь в отношении величины МА/Г, тогда как два других соотношения изменяются в дозах 10^-8 М и 10^-14 М однонаправленно. Это свидетельствует о большей физиологичности действия анфена по сравнению с феноксаном.

П р и м е р 2. Выявлялась БА полиуретановых пленок медицинского назначения (их гемосовместимость). Экспозиция эритроцитов (5% -ная взвесь) осуществлялась с пленками, покрывающими внутреннюю поверхность бюкс, в течение 20-40 мин. На фиг. 3 показаны относительные изменения величин показателей метаболизма и их соотношений для пленки "Витур Т" (Витур Т непереосажденный), на фиг. 4 - для пленки "Биомер". Пленка "Витур Т" приводит к резкому повышению ПОЛ (повышению Г и МА) со снижением величин Д/МА и АОА. Это свидетельствует о резком ухудшении состояния клеточной мембраны, характеризующимся засорением клетки малоновым альдегидом и снижением защиты от окисления. Это указывает на снижение адаптационной способности клетки и позволяет сделать вывод о неудовлетворительной гемосовместимости такого материала. Пленка "Биомер" дает умеренное увеличение ПОЛ без изменения соотношений параметров, что позволяет сделать заключение о физиологическом характере изменений, не затрагивающем систему адаптации, а следовательно, об удовлетворительной гемосовместимости.

П р и м е р 3. Выявлялась БА фитонапитков. Фитонапиток N 1 содержит экстракт пустырника, кориандра, донника, порошок тыквы, лимонную и аскорбиновую кислоты, сахар. Фитонапиток N 2 содержит экстракт золотого корня, хрена, чеснока, кориандра, порошка свеклы, сахар, лимонную и аскорбиновую кислоты.

В таблице приведены значения показателей метаболизма и их соотношений для трех доз "ин витро" фитонапитков. Из таблицы видно, что доза 50 мкл для обоих фитонапитков не является физиологичной, так как резко повышает ПОЛ, снижает соотношения Д/МА и АОА/МА, что свидетельствует об уменьшении адаптационных возможностей в клетке. По изменениям величин параметров можно заключить, что фитонапиток N 1 в минимальной дозе слабо снижает мембранный метаболизм (ПОЛ и Д) без изменения соотношений показателей. Это дает приближение к "комфортному" состоянию, имеющему место при покое. Поэтому можно сделать вывод, что в небольших количествах "ин виво" этот фитонапиток будет оказывать успокаивающее действие на организм. Увеличение дозы может привести к нежелательным изменениям клеточного метаболизма (повышению МА и снижению степени очистки от малонового альдегида).

Фитонапиток N 2 резко повышает ПОЛ (судя по увеличению Г и снижению МА/Г), не меняя Д/МА, снижая АОА/МА уже в дозе 5 мкл. В дозе 10 мкл понижающее мембранный метаболизм действие усиливается. Так как повышение активности ПОЛ и Д сопровождается увеличением модификации клеточной мембраны и активности всего организма (аналогично действию стресса), можно полагать, что этот напиток обладает действием, повышающим работоспособность и активность человека. Однако снижение АОА/МА заставляет отказаться от применения этого напитка в больших количествах, а также в любых количествах людям, находящимся в стрессовом состоянии. Таким образом, изобретение не только выявляет БА фитонапитков, но и дает основу для выработки рекомендаций по их дозировке "ин виво", позволяет оценить, при каких состояниях организма фитонапитки дают оптимально положительный эффект.

Изобретение обеспечивает расширение информативности способа определения БА веществ за счет выявления характера БА, повышение достоверности и упрощение способа. Способ пригоден для определения БА веществ любой консистенции - жидкостей, пленок, порошков, твердых тел, конденсатов газов. Он эффективен при определении БА фармакологических препаратов, продуктов питания, питательных смесей, фитонапитков, пленок медицинского назначения, материалов для детских игрушек и пищевой тары, примесей в питьевой воде. (56) 1. Патент США N 4440786, кл. C 07 C 59/52, 1984.

2. Corongin F. P. et al. Antioxidants and Lipid Peroxidation. "in vivo" Studies. "Biochemical Pharmacology", 1985, v. 34, N 3, p. 397-398.

3. Галкина С. И. Влияние различных форм витамина A и его сочетания с витамином Е на перекисное окисление липидов. Вопросы медицинской химии, 1984, N 4, с. 91-94.

4. Патент США N 4615877, кл. G 01 N 33/48, 1986.

5. Muller A. et al. A Novel Biological Active Seleno-Organic Compound-I, Glutathione Peroxidase - Like Activity in vitro and Antioxidant Capacity of PZ51 (Ebselen). "Biochemical Pharmacology", 1989, v. 33, N 20, p. 3235-3239.

Использование: медицина, биохимия, для определения биологической активности вещества. Технический результат заключается в расширении информативности способа, повышении его достоверности и упрощении. Сущность изобретения: испытуемое вещество инкубируют с препаратом свежеприготовленных эритроцитов, регистрируют показатели метаболизма эритроцитов - уровень малонового альдегида, степень гемолиза эритроцитов, интенсивность деградации малонового альдегида, антиокислительную активность, рассчитывают соотношения полученных показателей и по величине полученных соотношений, величине абсолютных значений измеренных показателей в опытном и контрольном образцах судят об активности вещества. 4 ил. , 1 табл.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВА, включающий приготовление контрольного и рабочего биологического препаратов клеточной субстанции живого организма, добавление испытуемого вещества в рабочий биологический препарат, инкубацию контрольного и рабочего биологических препаратов, определение в них показателей метаболизма, в качестве одного из которых используют содержание в биологическом препарате малонового альдегида, сравнение показателей метаболизма в контрольном и рабочем биологических препаратах и суждение о степени биологической активности испытуемого вещества заданной концентрации по величине изменений показателей метаболизма, отличающийся тем, что в качестве клеточной субстанции биологических препаратов используют свежеприготовленные эритроциты, в качестве показателей метаболизма дополнительно используют степень гемолиза эритроцитов, интенсивность деградации малонового альдегида и антиоксидантную активность, а после определения показателей метаболизма в контрольном и рабочем биологических препаратах рассчитывают соотношение
МА_рГ_p, МА_к/Г_к, Д_рМА_р, Д_кМА_к, АОА_рМА_р, АОА_кМА_к,
где МА_к, МАр - содержание малонового альдегида в контрольном и рабочем биологических препаратах соответственно;
Г_к, Г - соответственно степень гемолиза эритроцитов в контрольном и рабочих препаратах соответственно;
Д_к, Д_р - интенсивность деградации малонового альдегида соответственно,
АОА_к, АОА_р - антиокислительная активность в контрольном и рабочем препаратах соответственно;
при этом делают вывод о способности испытуемого вещества слабо изменить мембранный метаболизм, если Г_р - Г_к ≥ О, МА_р - МА_к ≥ О, Д_р - Д_к ≥ О, АОА_р - АОА_к ≥ О, МА_р/Г_р - МА_к/Г_к ≈ О, Д_р/МА_р - Д_к/МА_к ≈ О, АОА_р/МАр - АОА_к/МА_к ≈ О, о наличии у испытуемого вещества высокой биологической активности, инициирующей мембранный метаболизм, если Г_р - Г_к > О, МА_р - МА_к > О, Д_р - Д_к > О, АОА_р - АОА_к > О, МА_р/Г_р - МА_к/Г_к < О, Д_р/МА_р - Д_к/МА_к > О, АОА_р/МА_р - АОА_к/МА_к > О, о наличии у испытуемого вещества высокой биологической активности, угнетающей мембранный метаболизм, если Г_р - Г_к < О, МА_р - МА_к < О, Д_р - Д_к < О, АОА_р - АОА_к < О, МА_р/Г_р - МА_к/Г_к > О, Д_р/МА_р - Д_к/МА_к < О, АОА_р/МА_р - АОА_к/МА_к < О, о наличии у испытуемого вещества биологической активности, приводящей к паталогическим изменениям мембранного метаболизма, если изменения величин его показателей имеют разнонаправленный несбалансированный характер.