СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУХОГО ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА Российский патент 1996 года по МПК A61K35/74 C12N1/02 

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, в частности к получению пробиотических препаратов для лечения и профилактики дисбактериозов, вызванных нарушением естественного баланса кишечной микрофлоры различной этиологии.

Известно, что основным производственным путем получения медицинских препаратов на основе энтеробактерий (B.bifidum, Lb.acidohillum, Lb.plantarum, E. coli и др) является использование сублимационного метода обезвоживания взвеси живых микроорганизмов из культуральной жидкости. Одним из серьезных недостатков существующей технологии является длительность процесса обезвоживания препарата (60-65 и более часов) и достаточно высокий уровень брака (вспучивание, ухудшение показателей по активности, растворимости и т.д.). Указанное обстоятельство во многом объясняется свойствами нативных культуральных жидкостей с питательной средой на основе гидролизата казеина, в частности низкими значениями их эвтектических температур (минус 30-40^oC), что в значительной степени сдерживает интенсификацию процесса.

Цель изобретения сокращение длительности сублимационного обезвоживания и улучшения качества сухого препарата.

Поставленная цель достигается следующим образом. Штаммы энтеробактерий (например, Bifidumbacterium globosum БФ-4, Streptococus falcium ВГНКИ-27) выращивают в ферментационных аппаратах в жидкой питательной среде на основе ферментативного гидролизата казеина в течение 12-15 ч. Культуральную жидкость (КЖ) захолаживают до температуры 15-20^oC, концентрируют (микро- или ультрафильтрация, сепарирование) в 10-15 раз (по объему), отмывают от питательной среды замещающей жидкостью (ЗЭ), представляющей собой 2,5-3,5% раствор сахарозы или лактозы. Отмывку осуществляют путем разбавления концентрата замещающей жидкостью в соотношении 1:1 и повторного концентрирования до объема исходной суспензии. Отмывку проводят не менее двух раз.

Отмытую концентрированную суспензию (КС) высушивают сублимационным способом в неразбавленном виде (или предварительно разводят ЗЖ до требуемой концентрации клеток) при температуре греющих поверхностей, обеспечивающих температуру препарата в период сублимации свободной влаги минус 25-35^oC.

ПРИМЕР 1. Культуру штамма Bifidobacterium globosum БФ-4 засевают в ферментационный аппарат с жидкой питательной средой, приготовленной на основе ферментативного гидролизата казеина и инкубируют при температуре 37±1^oC в течение 12 ч. По окончании периода роста содержание жизнеспособных клеток бифидобактерий в культуральной жидкости составляет 10 млрд/мл. Полученную КЖ захолаживают до температуры 15^oC и концентрируют в 10 раз по объему микрофильтрацией на плоских мембранных элементах с размером пор 3,0 мк. Сконцентрированную суспензию (КС) с целью удаления из нее веществ с низким температурами затвердевания разбавляют в соотношении 1:1 по объему 3,5%-ным раствором сахарозы и концентрируют до начального объема КС, затем эту операцию по отмывке суспензии повторяют. Титр суспензии составляет 100 млрд. живых клеток в 1 мл. Для высушивания суспензию разливают слоем 10-12 мм в металлические поддоны или в стеклянные флаконы, замораживают до температуры минус 35^oC и высушивают на полочной сублимационной установке ТГ-15 в течение 30 ч (табл. 1). Полученная сухая биомасса (СБМ) представляет собой однородный монолитный слой и легко регидратируется в водных жидкостях. Концентрация жизнеспособных клеток после высушивания практически не снижается (табл. 2). Высушенный препарат стандартизуется по содержанию жизнеспособных клеток смешением с наполнителями и фасуется в герметичную тару для последующего использования в соответствии с рекомендациями по применению.

ПРИМЕР 2. Культуру штамма Bifidobacterium globosum БФ-4 получают как в примере 1, с тем отличием, что операции по сгущению охлажденной до 20^oС КЖ в 15 раз и последующей отмывки клеток проводят методом ультрафильтрации в ламинарном потоке на половолоконном разделительном аппарате типа АР-2 с размером пор 15000 Да (перепад давления 1,9 МПа,
средняя производительность по фильтрату около 30 л/ч). Полученную КС замораживают до температуры минус 30^oC и высушивают в течение 26-35 ч (табл. 1). Титр жизнеспособных клеток в образцах СБМ независимо от вида емкостей для высушивания (поддоны, флаконы) составляет от 600 до 2000 млрд. КОЕ/г (табл. 2).

ПРИМЕР 3. Культуру штамма Bifidobacterium globosum БФ-4 получают как в примере 1, с тем отличием, что длительность инкубирования культуры составляет 15 ч, а титр жизнеспособных клеток в КЖ-8 млрд. КОЕ/мл. КЖ сгущают на сепараторе типа в 15 раз при полупериодическом режиме работы (скорость вращения вала 9700 об/мин, расход суспензии 40 л/ч, периодичность выгрузки 50 мин). Полученную КС отмывают 2,5% раствором лактозы, замораживают как в примере 1 и высушивают в установке ТГ-15 при максимальной загрузке (15 л) в течение 35 ч (табл. 1).

ПРИМЕР 4. Культуру Streptococcus falcium штамм ВГНКИ 27 выращивают в жидкой питательной среде на основе ферментативного гидролизата казеина при температуре 37±1^oС в течение 13 ч. КЖ концентрируют методом ультрафильтрации в 10-15 раз (пример 2) и отмывают как в примере 1. Отмытую суспензию замораживают до температуры минус 35^oС и высушивают в течение 30-35 ч. Полученные образцы СБМ однородны, легко растворяются в водных жидкостях и содержат после высушивания 600-1000 млрд. жизнеспособных клеток в 1 г (табл. 3).

Таким образом, продолжительность периодов сублимационного обезвоживания отмытой концентрированной суспензии, как показано в табл. 1, 3 на примерах получения сухого препарата культур S.falcium и B.globosum, короче соответственно в 1,9 и 1,4 раза, чем нативный КЖ.

Кроме того, предлагаемый прием отмывки повышает выживаемость (до 100%) и качественные показатели сухой биомассы (биологическая активность, растворимость), о чем свидетельствуют данные табл. 2, 3, а концентрирование улучшает условия стандартизации препаратов по содержанию жизнеспособных клеток. ТТТ1 ТТТ2 ТТТ3

Использование: медицина, ветеринария, пробиотик, лечение дисбактериозов. Сущность изобретения: штамм энтеробактерий, например Bifidobacterium globosum БФ-4 или Streptococcus falcium ВГНКИ - 27, выращивают в жидкой питательной среде на основе ферментативного гидролизата казеина в течение 12-15 ч. Нативную культуральную жидкость охлаждают до температуры 15-20^oC и концентрируют в 10-15 раз. Полученную концентрированную биомассу отмывают 2,5-3,5%-ным раствором сахарозы или лактозы и обезвоживают при температуре минус 25- минус 35^oС. При этом концентрирование нативной культуральной жидкости проводят методом ультрафильтрации на полых волокнах или микрофильтрацией на плоских мембранах, или сепарированием в полупериодическом режиме работы. 3 з.п.ф-лы, 3 табл.

1. Способ получения сухого пробиотического препарата путем выращивания культур энтеробактерий в жидкой питательной среде на основе ферментативного гидролизата казеина и сублимационного обезвоживания, отличающийся тем, что охлажденную до 15 20°С нативную культуральную жидкость концентрируют в 10-15 раз, затем полученную концентрированную биомассу отмывают 2,5-3,5%-ным раствором сахарозы или лактозы, а обезвоживание ведут при температуре минус 25- минус 35°С. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрирование нативной культуральной жидкости проводят методом ультрафильтрации на полых волокнах с размером пор 15 000 Да в ламинарном потоке при перепаде давления 1,9 МПа и средней производительности по фильтрату 30 л/ч. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрирование нативной культуральной жидкости проводят методом микрофильтрации на плоских мембранах с размером пор не более 3 мкм. 4. Способ по п.1, отличающийся тем,что концентрирование нативной культуральной жидкости проводят методом сепарирования в полупериодическом режиме работы при скорости вращения вала 9700 об/мин, расходе культуральной жидкости 40 л/ч и периодичности выгрузки 50 мин.