СПОСОБ ПЕРВИЧНОГО ОТБОРА ВЕЩЕСТВ, ОБЛАДАЮЩИХ ПРОТЕКТИВНЫМИ СВОЙСТВАМИ Российский патент 1996 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к радиобиологии неионизирующих излучений, а именно к способам подбора лекчекбных и профилактических медикаментозных средств для коррекции биоэффектов электромагнитного облучения в эксперименте, в том числе в период эмбрионального развития организма.

С каждым годом все более расширяется использование электромагнитных полей (ЭМП), например, СВЧ диапазона, в различных областях народного хозяйства, увеличивается количество источников электромагнитного неоионизирующего излучения, и соответственно возрастают контингенты людей, подвергающихся воздействию этого фактора, что сопряжено с разнообразными изменениями в организме вплоть до патологических состояний [Давыдов Б.И. Тихончук В.С. Антипов В. В. Биологическое действие, нормирование и защита от электромагнитных излучений. М. Медицина, 1984, 296 с. При этом, как известно [Антипов В.В. Давыдов Б.И. Тихончук В.С. Биологическое действие излучений микроволнового диапазона. М. Наука, 1984, с. 188] при облучении ЭМП в наибольшей степени страдают организмы в период эмбрионального развития. Поиск и разработка эффективных лекарственных препаратов для коррекции эффектов облучения ЭМП является актуальной проблемой радиобиологии неионизирующих излучений, имеющей большое социальное значение. Существует необходимость разработки эффективных методов скрининга веществ, способных оказывать протекторное действие при облучении ЭМП, особенно, на стадиях эмбрионального развития.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению является способ первичного скрининга лекарственных препаратов-протекторов для коррекции биоэффектов сверхвысокочастотного (СВЧ) электромагнитного облучения в эксперименте с использованием в качестве биологических объектов мелких грызунов лабораторных белых мышей и крыс [Колдаев В.М. Экспериментальная модификация острых микроволновых эффектов. Автореф. дисс. докт.б.н. М. 1987, с. 22] включающий воздействие ЭМП на биообъекты. Недостатками этого способа является то, что скрининг занимает сравнительно длительное время: от нескольких недель до нескольких месяцев, крайне затруднительно провести скрининг протекторов в период эмбрионального развития, при реализации модели требуется большое количество животных, что сопряжено со значительными расходами на самих животных, их содержание и др.

Задачей изобретения является первичный отбор веществ, способных оказывать протекторный эффект при воздействии ЭМП, в том числе в период эмбрионального развития. При осуществлении изобретения достигается следующий технический результат: время определения протекторной эффективности исследуемого вещества сокращается в 12-200 раз, возможно подбирать протекторы на стадии эмбрионального развития, исключается использование большого количества дорогостоящих лабораторных грызунов и соответственно сокращаются расходы на самих животных, их содержание и др.

Для достижения технического результата в качестве биообъекта используют эмбрионы морских ежей на любой начальной ступени развития вплоть до плутеуса, инкубируемые в морской воде с исследуемым веществом с последующей отмывкой чистой морской водой, до инкубации или после нее объекты подвергают воздействию ЭМП и наблюдают за последующим развитием, по степени отличия которого от развития облученных ЭМП без применения вещества эмбрионов (контроль) судят о протекторной эффективности исследуемого вещества.

Предлагаемый способ первичного скрининга протекторов облучения ЭМП реализуют следующим образом, зиготы, полученные от половозрелых морских ежей стандартным способом [Бузников Г.А. Подмарев В.К. Объекты биологии развития. М. Наука, 1975, с. 188-216] инкубируют в морской воде с исследуемым веществом, многократно отмывают чистой морской водой; в зависимости от поставленной перед исследователем задачи зиготы облучают ЭМП после инкубации (профилактическое применение веществ) или до инкубации (коррегирующее применение веществ), и производят наблюдение за их развитием (опыт), одновременно ведут наблюдения за развитием облученных аналогичных зигот, но без применения исследуемого вещества (контроль), об эффективности исследуемого вещества судят по относительному количеству зигот, достигнувших определенной стадии развития за одно и то же время в "опыте" и в "контроле".

Предлагаемая модель скрининга может использоваться для первичного отбора веществ, способных оказывать протекторный эффект при воздействии ЭПМ в эксперименте, в том числе в период эмбрионального развития.

При проведении патентных исследований в доступных нам источниках информации не выявлено известных технических решений той же задачи, характеризующейся той же совокупностью признаков, следовательно, предлагаемая модель соответствует критерию "новизна".

П р и м е р 1. Применение веществ из фармакологической группы соединений, повышающих устойчивость организма к экстремальным воздействиям. Испытание из их числа на протекторную эффективность при облучении ЭМП, например, натрия оксибутирата (натриевая соль гамма-оксимасляной кислоты), повышающего устойчивость организма к экстремальным воздействиям, а также к гипоксии [Натрия оксибутират. БМЭ. М. Советская энциклопедия, 1981, с. 195-196] которая может развиваться при облучении ЭМП. Вероятно, оксибутират натрия может проявить протекторные свойства при воздействии ЭМП, однако такие его свойства заранее не известны и нужна экспериментальная проверка. Оксибутират натрия применяют в данном случае до облучения ЭМП на стадии оболочки; наблюдения продолжают до стадии 4-х бластометров.

Половозрелые яйца морских ежей вида Strongylocentrotus nudus, полученные стандартным способом [Бузников Г.А. Подмарев В.К. Объекты биологии развития. М. Наука, 1975, с. 188-216] вносят объемом примерно 5 мл в мерный стеклянный сосуд объемом 500 мл, заполненный на половину морской водой, после оседания яиц замечают занимаемый ими объем, надосадочную жидкость осторожно удаляют и к яйцам добавляют 50-ти кратное количество морской воды, что является интактной взвесью яиц морских ежей. Одновременно готовят взвесь спермы морских ежей того же вида стандартным способом по [Бузников Г.А. Подмарев В.К. Объекты биологии развития. М. Наука, 1975, с. 188-216] что является интактной взвесью спермы.

Из полученной интактной взвеси яиц готовят 4 пробы в 4-х разных сосудиках-чашках Петри диаметром 40 мм (ТУ 64-2-19-79), для чего сразу после осторожного взбалтывания пипеткой-дозатором П1-2.0 отбирают 2 мл, которые вносят в сосудики. Во все сосудики вносят 1-2 капли приготовленной интактной взвеси спермы, засекают время. Через 1,5-2 мин, в 1-ый (интактные) и 2-ой (контроль 1) сосудики добавляют такой же (2 мл) объем чистой морской воды, в 3-ий (контроль 2) и 4-ый (опыт) сосудики добавляют исследуемое вещество оксибутират натрия, растворенное в том же объеме морской воды (в 2-х мл), в дозе 200 мг/л, концентрация вещества в сосудике в этом случае будет составлять соответственно 100 мг/л, инкубируют в течение 10 мин.

Содержимое 4-го сосудика (опыт) и содержимое 2-го сосудика (контроль 1) облучают ЭМП дециметрового диапазона с помощью специальной установки [Колдаев В.М. Щепин Ю.В. Устройство для электромагнитного облучения биообъектов. Положительное решение по заявке 4829615/14(038321), кл. А 61 N 5/00] в течение 8 мин, при мощности излучения 10 Вт, затем тщательно промывают чистой морской водой 5-6 раз в течение 2,5-3 мин содержимое 3-го и 4-го сосудиков с помощью сифона, после промывки объем их доводят до прежнего объема 4 мл чистой морской водой. После облучения за всеми 4-мя пробами наблюдают 1 ч 50 мин 2 ч, до стадии 4-х бластомеров под микроскопом МБС-10 подсчитывают количество эмбрионов, достигших стадии развития 4-х бластомеров, выражая его в процентах на 100 клеток в поле зрения. Результаты эксперимента примера 1 приведены в табл. 1.

Из полученных данных видно, что применение препарата практически не повлияло на дальнейшее развитие эмбрионов: разность между интактными (без препарата, необлученные) и контролем 2 (с препаратом, необлученные) не достоверна (р > 0,05); применение препарата до облучения повысило в 1,48 раза количество эмбрионов, достигающих стадии 4-х бластомеров: разность между контролем 1 (облученные без препарата) и опытом (облученные с препаратом) достоверная (р < 0,05). Время от начала эксперимента до получения результата составляет порядка 2,5 ч, в то время как на известной модели прототипе 3 недели.

П р и м е р 2. Испытание натрия оксибутирата по примеру 1, препарат применяют до облучения ЭМП на стадии поздней бластулы-2, наблюдения продолжают до стадии раннего плутеуса-3.

Готовят взвесь яиц и спермы морских ежей вида Strongylocentrotus intermedius и ставят 4 пробы: интактные, контроль 1, контроль 2, опыт, все пробы осеменяют приготовленной спермой аналогично примеру 1. Во всех пробах наблюдают за развитием эмбрионов до стадии поздней бластулы-2 в течение 12-13 ч, затем в сосудики с контролем 2 и опытом добавляют раствор на морской воде исследуемого вещества оксибутиpата натрия в конечной дозе 100 мг/л, а в сосудики с интактными и контролем 1 добавляют эквивалентное количество чистой морской воды. После 10 мин инкубации содержимое сосудиков с контролем 2 и опытом отмывают чистой морской водой 5-6 раз с помощью сифона, их объем доводят до изначального (4 мл). После этого контроль 1 и опыт облучают аналогично примеру 1. За всеми пробами наблюдают до стадии раннего плутеуса-3 в течение 38-42 ч, подсчитывают количество эмбрионов, достигших этой стадии развития во всех сосудиках. Результаты подсчетов приведены в табл. 2.

Как видно из табл. 2, оксибутират натрия практически не повлиял на развитие эмбрионов: разница между интактными (без препарата, необлученные) и контролем 2 (с препаратом, необлученные) не достоверна (р > 0,05); применение препарата до облучения повысило количество эмбрионов, достигших стадии раннего плутеуса-3, в 1,32 раза по сравнению с облученными без препарата: разность между контролем 1 (облученные без препарата) и опыта (препарат + облучение) достоверна (р < 0,05).

Таким образом, результаты примеров 1 и 2 показывают, что антигипоксант оксибутират натрия проявляет протекторные свойства при облучении ЭМП на разных стадиях эмбрионального развития и его можно включить в группу препаратов, обладающих потенциальной профилактической эффективностью и порекомендовать для дальнейших более углубленных исследований, а также можно рекомендовать испытание при облучении ЭМП и других веществ с антигипоксическим действием из группы соединений, повышающих устойчивость организма к экстремальным воздействиям.

П р и м е р 3. Применение веществ из фармакологической группы средств, влияющих на процессы обмена веществ, а именно препарата, стимулирующего метаболические процессы, фосфобиона (кислота аденозинтрифосфорная, трифосфорный эфир 9-бета-D-рибофуранозида), который участвует в обмене веществ с освобождением энергии, использующейся для синтетических процессов белка, мочевины и промежуточных продуктов обмена [Машковский М.Д. Лекарственные средства. Часть 2. Кишинев: Картя Молдовеняскэ. 1989, с. 124-125] Поскольку при облучении ЭМП происходят нарушения метаболических процессов, то, вероятно, фосфобион может проявить корригирующие свойства после облучения ЭМП, однако такие его свойства заранее не известны и требуется экспериментальное исследование. Препарат в примере 3 применяют после облучения ЭМП на стадии оболочки, наблюдения продолжают до стадии 4-х бластомеров.

Готовят взвесь яиц и спермы морских ежей, затем ставят 4 пробы: интактные, контроль 1, контроль 2 и опыт; все пробы осеменяют, контроль 1 и опыт облучают ЭМП аналогично примеру 1. После облучения в сосудики контроля 2 и опыта (пробы 3 и 4) вносят раствор на морской воде исследуемого вещества фосфобиона в конечной дозе 25 мг/л, пробы 3 и 4 инкубируют с исследуемым веществом 10 мин, затем тщательно отмывают, как в примере 1. За всеми пробами наблюдают до стадии 4-х бластомеров. Результаты эксперимента приведены в табл. 3.

Из приведенных данных видно, что применение фосфобиона практически не повлияло на дальнейшее развитие эмбрионов: разность между интактными (без препарата, необлученные) и контролем 2 (с препаратом, необлученные) недостоверна (р > 0,05); применение препарата после облучения повысило почти 1,23 раза количество эмбрионов, достигающих стадии 4-х бластомеров: разность между опытом (облучение + препарат) и контролем 1 (облученные, без препарата) достоверна (р < 0,05).

Как показывают результаты примера 3, фосфобион оказывает корригирующее действие при использовании после облучения ЭМП и его можно порекомендовать для дальнейших испытаний, а также можно порекомендовать и другие вещества из разряда стимуляторов метаболических процессов в качестве корригирующих после облучения ЭМП.

Таким образом, примеры 1, 2 и 3 показывают, что предлагаемый способ первичного скрининга протекторов может использоваться в эксперименте для подбора веществ, оказывающих защитный или корригирующий эффект при облучении ЭМП, при этом сокращается количество животных и продолжительность наблюдений (табл. 4).

Использование: радиобиология неионизирующих излучений для отбора веществ, пригодных для коррекции биоэффектов электромагнитного облучения в эксперименте. Сущность: на эмбрионы морских ежей воздействуют электромагнитным полем до или после инкубации в морской воде с исследуемым веществом и последующей отмывкой в чистой морской воде; характер их дальнейшего развития служит показателем протективных свойств исследуемого вещества. 4 табл.

СПОСОБ ПЕРВИЧНОГО ОТБОРА ВЕЩЕСТВ, ОБЛАДАЮЩИХ ПРОТЕКТИВНЫМИ СВОЙСТВАМИ, в условиях воздействия электромагнитным полем, включающий помещение биообъекта в электромагнитное поле и регистрацию показателей, характеризующих нормализацию состояния биообъекта на фоне его обработки испытуемым веществом, отличающийся тем, что в качестве биообъекта используют эмбрионы морских ежей, которых помещают в электромагнитное поле после инкубации в морской воде с добавленным к ней испытуемым веществом, затем отмывают биообъект морской водой, лишенной испытуемого вещества, и при нормализации эмбрионального развития биообъекта осуществляют отбор вещества.