СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕРАПИИ БОЛЬНЫХ С ГИПЕРПЛАЗИЕЙ ЭНДОМЕТРИЯ Российский патент 1996 года по МПК G01N33/92 

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии.

Гиперпластические заболевания эндометрия относят к числу наиболее распространенных патологических процессов матки. Многочисленные исследования указывают на значительное возрастание частоты гиперпластических процессов в эндометрии у женщин репродуктивного возраста (Кондриков Н.И. Структурно-функциональные основы гиперпластических изменений эндометрия женщины: Афтореф. дис. докт. мед. наук. М. 1991, с. 46). Основным методом терапии гиперпластических заболеваний эндометрия является гормональное лечение. Вместе с тем до настоящего времени не разработаны объективные, неинвазивные, высокоинформативные методы контроля за эффективностью проводимого лечения у данного контингента больных. В результате чего нередко имеет место неадекватная терапия, отсутствует возможность прогнозирования течения заболевания, наблюдается высокая частота рецидивов и необоснованные хирургические вмешательства, вплоть до удаления матки.

Известен ультразвуковой способ оценки эффективности проводимой терапии гиперпластической патологии эндометрия на основе изучения размеров и структуры срединного М-эха (Лечение больных с доброкачественными гормонально-зависимыми заболеваниями матки и молочных желез (методические рекомендации МЗ СССР, 1989)). Однако данный способ не позволяет достоверно проводить контроль за лечением больных, что связано с разрешающими возможностями УЗИ.

Известен также цитологический способ оценки эффективности проводимой терапии путем изучения содержимого полости матки, полученного аспирационным методом (Бодяжина В.И. Сметник В.П. Тумилович Л.Г. Неоперативная гинекология. М. 1990, с. 544). Вместе с тем аспирационно-цитологический способ не дает отчетливого представления о состоянии слизистой оболочки матки. Во многом это связано с тем, что адекватная диагностика патологического процесса эндометрия основывается на морфологическом анализе соотношения и особенностей структуры эпителиального и стромального компонентов всей слизистой оболочки матки, а это вне пределов возможности цитологического метода исследования.

Известен гистологический способ оценки эффективности проводимой терапии гиперпластических заболеваний эндометрия, который является наиболее достоверным [1] Вместе с тем получение материала для гистологического исследования осуществляется путем инвазивного воздействия выскабливания слизистой оболочки матки. Последнее имеет следующие недостатки: травматичность (перфорация матки, повреждение шейки матки, возможное ранение органов брюшной полости, кровотечение), анестезиологические осложнения (вплоть до смерти), инфицирование (СПИД, гепатит). Кроме того, для последующего контроля за эффективностью проводимой терапии требуется повторное выскабливание слизистой оболочки матки, что каждый раз далеко не безразлично для организма.

Таким образом, известные способы оценки эффективности проводимой терапии у больных с гиперпластической патологией эндометрия имеют существенные недостатки, поскольку не позволяют проводить объективный, высокоинформативный, неинвазивный контроль за лечением данного контингента больных.

Задачей изобретения является создание высокоинформативного, неинвазивного способа определения эффективности проводимой терапии у больных с гиперплазией эндометрия, позволяющего проводить адекватную терапию и прогнозировать дальнейшее течение заболевания.

Сущность изобретения состоит в том, что в способе определения эффективности проводимой терапии у больных с гиперплазией эндометрия, включающем исследование цельной крови методом проточной горизонтальной хроматографии, отличительной особенностью является то, что до и после проведения курса лечения проводят определение уровня содержания фосфотидилинозитов (ФИ) и фосфатидилинозит-3-фосфатов (ФИФ¹) и на основании их сравнительного анализа определяют эффективность проведенной терапии, при этом при повышении уровня содержания ФИ от 7,0 до 7,5 нмоль фосфора ФИ на мг белка, а ФИФ¹ от 0,21 до 0,23 нмоль фосфора ФИФ¹ на 1 мг белка судят об эффективности проведенной терапии и благоприятном течении заболевания, при неизменном или сниженном уровне содержания после лечения ФИ от 5,5 до 6,0 нмоль фосфора ФИ на 1 мг белка, а ФИФ¹ от 0,11 до 0,14 нмоль фосфора ФИФ¹ на 1 мг белка судят о неэффективности проведенной терапии и неблагоприятном течении заболевания.

Использование изобретения позволяет получить следующий технический результат. Способ обладает высокой точностью и объективностью и позволяет определять ФИ и ФИФ¹ при малейших изменениях их концентрации. Точность способа составляет 95,2% Способ является неинвазивным, благодаря чему значительно уменьшается опасность инфицирования и хирургического риска. Высокая информативность способа позволяет проводить объективный контроль за эффективностью проводимой терапии, дает возможность осуществлять прогнозирование течения заболевания на основе сравнения объективных показателей цельной крови, способствует значительному снижению рецидивов и обеспечивает назначение адекватной терапии, что уменьшает число необоснованных хирургических вмешательств. Способ позволяет своевременно предупреждать прогрессирование заболевания и назначать адекватную терапию.

Фосфоинозитиды (ФИ и ФИФ¹) являются одним из основных компонентом биологических мембран. Важная роль фосфоинозитидов в жизнедеятельности клеток связана с их непосредственным участием в транспортной, энергетической и пластической функции мембран клеток. Они выполняют в организме важную регуляторную роль и имеют непосредственное отношение к процессу пролиферации клеток. Одновременно установлено, что содержание фосфоинозитидов в крови отражает специфику обменных процессов, происходящих в организме, поскольку установлено участие инозитсодержащих липидов в переходе клеток к неконтролируемому росту и трансформации. Однако использование уровня этих соединений для оценки эффективности проводимой терапии ранее не проводилось.

Способ осуществляется следующим образом. Из 0,5 мл цельной крови экстрагируют липиды смесью хлороформ-метанол (1:1), фильтруют, осадок на фильтре четерхкратно промывают смесью хлороформ-метанол (2:1), содержащей 1% НСl по объему. К фильтрату добавляют 0,4 мл 0,02% хлористого кальция, затем в течение 4-5 мин перемешивают. После четкого расслоения верхнюю фазу отсасывают и экстракт четырехкратно промывают смесью хлороформ-метанол 0,02% СаСl₂ (3:48: 47). После отмывания отбирают на 1/20 от имеющегося объема для определения липидного фосфора. Оставшийся липидный экстракт упаривают в токе азота, предварительно внеся в хлороформную фазу 3 мкл антиоксиданта, ионола, и растворяют в 50-70 мкл хлороформ-метанола (2:1). Исследуемый липидный материал наносят на хроматографическую пластинку в виде сплошной узкой полосы на расстоянии 2 см от нижнего края пластинки. Пластинку помещают в плоскую стеклянную камеру для проточной горизонтальной хроматографии. Силикагель марки Л 5/40 "Chemapol" (Чехословакия) наносят на пластинку путем осаждения из разбавленных водных суспензий, содержащих 5% К₂СO₃, затем слой адсорбента высушивают на воздухе и далее активируют в специальном шкафу при температуре 120^оС 15 мин. Выделение фосфоинозитидов проводят в системе хлороформ-метанол-7 н. аммиак (13:7:1). При этом фронт растворителя достигает края пластинки через 60 мин, после чего хроматографию продолжают в условиях протока (15 мин), что способствует разнице в хроматографической подвижности фосфоинозитидов и расположенных рядом фракций. Исследуемая фракция фосфоинозитидов (Rf 0,47) четко отделяется от расположенных рядом фракций фисфатидилсеринов (Rf 0,58) и фосфатидилхолинов (Rf 0,34). Идентификацию фосфолипидных фракций проводят с помощью цветных тестов, значений Rf и свидетелей фирмы "Sigma" (США). По окончании хроматографии пластинку высушивают до полного удаления растворителей. Участок сорбента с фракцией фосфоинозитидов (Rf 0,47) обводят препаровальной иглой и собирают в пробирку с 10 мл смеси метанол-соляная кислота (1: 1) при помощи водоструйного насоса. Собранный силикагель встряхивают 10 мин с этой смесью растворителей и отстаивают в течение 60 мин. Затем фильтруют, а гель на фильтре еще четырехкратно промывают в 5 мл той же смеси. Объединенный элюат упаривают в токе азота, предварительно внеся в него 5 мкл ионола, растворяют в 20 мкл смеси хлороформ-метанол (2:1) и наносят на хроматографическую пластинку в виде точки (5-7 мкл). Силикагель наносят на хроматографическую пластинку путем осаждения из разбавленных водных суспензий, содержащих 15% К₂СО₃. Пластинки активируют в сушильном шкафу при температуре 130^оС 20 мин. Фракционирование фосфоинозитидов проводят в системе хлороформ-метанол-7 н. аммиак (11:4,5:1) в течение 90 мин. При этом фронт растворителя достигает края пластинки через 70 мин, после чего хроматографию продолжают в условиях протока. Параллельно с исследуемыми образцами наносят на пластинку свидетели фосфоинозитидов фирмы "Sigma" (США). Установлено, что фракции фосфоинозитидов на хроматограммах располагаются в порядке возрастания Rf:ФИ (Rf 0,18), ФИФ¹ (Rf 0,34). Хроматограммы после высушивания сжигают непосредственно над хромовой смесью в специальном эксикаторе, помещенном в сушильном шкафу при температуре 200^оС на 40 мин. Количественное содержание ФИ и ФИФ¹ определяют денситометрическим методом на аппарате "БИАН-170" (Россия). Перед нанесением исследуемого экстракта слой силикагеля разделяют на 12-15 узких полос по 4-5 мм каждая, что обеспечивает одинаковую ширину денситометрируемых пятен. При таких условиях распределение анализируемого вещества происходит только по ходу растворителя, исключая возможность продольной сорбции. Распределение липидного материала в пятне практически обеспечивает пропорциональность между количеством фракций фосфоинозитидов и площадью их пиков. При этом имеется возможность в стандартных условиях анализировать на каждой пластинке одновременно до 15 проб. Для построения калибровочной кривой используют стандартные препараты ФИ и ФИФ¹ (фирмы "Sigma" (США), которые наносят на отдельные полосы силикагеля так, чтобы концентрация липидного фосфора составляла 1, 2, 3, 4, 4, 6, 7, 8 мкг соответственно. После хроматографии пластинку проявляют над раствором хромовой смеси при температуре 200^оС в течение 30 мин, затем проводят денситометрию. По данным денсинометрии строят калибровочную кривую. Фракцию фосфоинозитидов определяют в диапазоне от 0,2 до 8 мкг. После сжигания исследуемых проб в парах хромовой смеси обугленное вещество переносят в специальные колбочки с 0,5 мл азотной кислоты. Содержимое колбочек выпаривают в пламени спиртовки, после чего их продолжают прогревать до прекращения выделения бурых паров. В остывшие колбочки помещают 1,0 мл 2%-ной аскорбиновой кислоты на 10% трихлоруксусной кислоты и тщательно встряхивают. Затем приливают 0,5 мл 1%-ного молибдата аммония, перемешивают и для устойчивой окраски оставляют на 1 ч. Колориметрирование проводят с помощью колориметра-нефелометра КФК-2-УХЛ4 при длине волны равной 670 нм. Одновременно с исследуемыми растворами колориметрируют "холостые" пробы, не содержащие фосфора, и стандартные растворы, содержащие 0,1 мкг фосфора. Расчет содержания фосфора осуществляют путем сравнения оптических плотностей анализируемых и стандартных растворов. Результаты выражают в нмолях фосфора, соответствующего фосфоинозитида на 1 мг белка. Количество белка определяют биуретовым способом.

При этом уровень содержания в крови исследуемых фосфоинозитидов до лечения больных с железистой гиперплазией эндометрия составляет: ФИ от 6,0 до 6,5 нмоль фосфора ФИ на 1 мг белка, а ФИФ¹ от 0,14 до 0,16 нмоль фосфора ФИФ¹ на 1 мг белка. Больным проводят наиболее распространенное (гормональное) лечение заболевания путем назначения комбинированных эстроген-гестагенных препаратов (нон-овлон), который назначают по 1 таблетке в день с 5 до 25 дней менструального цикла в течение трех месяцев (Лечение больных с доброкачественными гормонально-зависимыми заболеваниями матки и молочных желез (Методические рекомендации МЗ СССР) М. 1989, с. 28). Контроль за эффективностью проведенной терапии выполняют в общепринятые сроки (через 6 мес.): определяют в крови уровень содержания ФИ и ФИФ¹, а также проводят диагностическое выскабливание слизистой оболочки матки с последующим его гистологическим исследованием. Осуществляют сравнительный анализ названных биохимических показателей до и после проведенного курса лечения. Повышение в крови уровня содержания фосфоинозитидов после курса лечения (ФИ: от 7,0 до 7,5 нмоль фосфора ФИ на мг белка, ФИФ¹ от 0,21 до 0,23 нмоль фосфора ФИФ¹ на мг белка) свидетельствует об эффективности проведенной терапии и благоприятном течении заболевания. Если после проведенной терапии наблюдается неизменный или сниженный уровень фосфоинозитидов (ФИ от 5,5 до 6,0 нмоль фосфора ФИ на 1 мг белка, а ФИФ¹ от 0,11 до 0,14 нмоль фосфора ФИФ1 на 1 мг белка), это свидетельствует о неэффективности проведенной терапии и неблагоприятном течении заболевания.

П р и м е р 1. Больная П. 38 лет, истоpия болезни N 14089, находилась на обследовании в гинекологическом отделении больницы им. С.П.Боткина. При проведении гистероскопии диагностирована "гиперплазия эндометрия". При гистологическом исследовании удаленной ткани слизистой оболочки матки (гистология N 27325-29) установлена "железистая гиперплазия эндометрия". Больной проведено определение в цельной крови уровня фосфоинозитидов вышеперечисленным способом (ФИ 6,2 нмоль фосфора ФИ на 1 мг белка, ФИФ¹ 0,14 нмоль фосфора ФИФ¹ на 1 мг белка). Больной была назначена гормональная терапия принимала нон-овлон по 1 таблетке в день в циклическом режиме (с 5 по 25 день менструального цикла с 7 дневным промежутком) в течение трех месяцев. Через шесть месяцев больная поступила для контрольного обследования. Было проведено определение в цельной крови уровня фосфоинозитидов (ФИ 7,2 нмоль фосфора ФИ на 1 мг белка, ФИФ¹ 0,22 нмоль фосфора ФИФ¹ на 1 мг белка). При УЗИ органов малого таза гинекологической патологии установлено не было. При гистероскопии и гистологическом исследовании ткани слизистой оболочки матки (гистология N 42182-89) установлено, что эндометрий имеет обычное строение и соответствует фазе секреции.

П р и м е р 2. Больная Л. 39 лет, история болезни N 2775, находилась на обследовании в больнице им. С.П.Боткина. При комплексном обследовании было проведено количественное определение в цельной крови содержания фосфоинозитидов вышеприведенным способом (ФИ составили 6,3 нмоль фосфора ФИ на 1 мг белка, ФИФ¹ 0,14 нмоль фосфора ФИФ¹ на 1 мг белка). Было высказано предположение о железистой гиперплазии эндометрия. При газовой гистероскопии и гистологическом исследовании ткани эндометрия (гистология N 5829-31) подтверждена "железистая гиперплазия эндометрия". Больная в течение трех месяцев принимала нон-овлон по 1 таблетке в день с 5 до 25 день менструального цикла. Через шесть месяцев пациентка поступила для контрольного обследования. В крови уровень содержания ФИ составил 5,8 нмоль фосфора ФИ на 1 мг белка, а ФИФ¹ 0,12 нмоль фосфора ФИФ¹ на 1 мг белка. При гистероскопии было установлена "гиперплазия эндометрия". При гистологическом исследовании удаленной ткани слизистой оболочки матки (гистология N 33675-81) также установлена "железистая гиперплазия эндометрия". Окончательный диагноз: "рецидивирующая железистая гиперплазия эндометрия".

Использование: медицина, в частности гинекология. Сущность изобретения: у пациента берут цельную кровь, выделяют липидную фракцию, в которой методом проточной горизонтальной хроматографии определяют уровень фосфатидилинозитов и фосфатидилинозит-3-фосфатов и при значении первого показателя после терапии 7,0-7,5 нмоль фосфора на 1 мг белка, второго показателя -0, 21-0,23 нмоль фосфора на 1 мг белка судят об эффективности лечения, а при неизменном уровне первого показателя или его значении 5,5-6,0 нмоль фосфора на 1 мг белка, значении второго показателя 0,11-0,14 нмоль фосфора на 1 мг белка судят о неэффективности терапии.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕРАПИИ БОЛЬНЫХ С ГИПЕРПЛАЗИЕЙ ЭНДОМЕТРИЯ, включающий исследование биологического материала в динамике до и после проводимой терапии, отличающийся тем, что у пациента берут цельную кровь, выделяют липидную фракцию, в которой методом проточной горизонтальной хроматографии определяют уровень фосфатидилинозитов и фосфатидилинозит-3-фосфатов и при значении первого показателя после терапии 7,0 - 7,5 нмоль фосфора/мг белка, второго показателя 0,21 - 0,23 нмоль фосфора/мг белка судят об эффективности терапии, а при неизменном уровне первого показателя в сравнении с исходным или его значении 5,5 - 6,0 нмоль фосфора/мг белка и значении второго показателя 0,11 - 0,14 нмоль/мг белка судят о неэффективности терапии.