СПОСОБ ЭКСТРАКЦИИ ФЕРМЕНТОВ ИЗ ЛИЗИРОВАННЫХ ЭРИТРОЦИТОВ Российский патент 1996 года по МПК A61K35/14 A61K35/18 

Изобретение относится к медицинской биохимии и энзимологии, а также к фармакологии, и может быть использовано для создания фармакологических препаратов.

Известны способы получения из эритроцитов крови экстрактов, лишенных гемоглобина и содержащих ферменты: каталазу (Tsuchihashi M. Zur Kenntins der BlutKatalase. 1923. 63. P.140; Bonnichsen R. Blood catalase. Meth. Enz. 1955. V. 2. P.781-784), карбоангидразу (Waygood E.R. Carbonic anhydrase. Meth. Enz. 1955. V.2 P.836-847; Bergenhem N. Carlsson U. Klasson K. Rapid ion-exchange chromatography for preparative separation of proteins. Application to porcine and bovine carbonic anhydrases. J.Chr. 1985. V.319. P.59-65) и супероксиддисмутазу (McCord J.M. Fridovuch I. Superoxide dismutase. An enzymatic function for erythrocuprein. J. Biol. Chem. 1969. V.244, N 22. P. 6049-6055), путем обработки лизированных эритроцитов смесью галогенсодержащего углеводорода, хлороформа и этилового спирта. Эти способы, впервые предложенные Tzuchihashi в 1923 г. широко используются вплоть до настоящего времени.

Наиболее близким техническим решением, избранным в качестве прототипа, является экстракция супероксиддисмутазы из лизированных эритроцитов смесью хлороформа и этилового спирта при объемной концентрации хлороформа в смеси 38% и при соотношении объема лизата к объему экстрагента 1:0,4. Экстракция осуществляется при обычном перемешивании в течение 15-20 мин при 0^оС. Выход экстракта из 5 л отмытых упакованных эритроцитов составляет 6,7 л (Inoue K. Nakamura K. Mitoma Y. Matsumoto M. Igarashi T. Application of a new ion-exchanger TSK-gel DEAE 5 PW to the purification of Cu, Zn-superoxide dismutase from bovine erythrocytes. J. Chr. 1985. V.327. P.301-311).

Недостатками указанного способа является неполное извлечение целевых ферментов из исходного сырья при экстракции, приводящее к снижению выхода, а также недостаточная селективность экстракции, приводящая к загрязнению получаемого экстракта примесными соединениями, такими как плазматические белки. Другим недостатком является использование высокотоксичного соединения хлороформа (ПДК 20 мг/м³), являющегося наркотиком, способным вызывать заболевания внутренних органов (Юдин К.А. Техника безопасности при работе с химическими веществами. М. Профиздат, 1964).

Указанные недостатки устраняются тем, что при экстракции ферментов из лизированных эритроцитов смесью галогенсодержащего углеводорода и этилового спирта в качестве галогенсодержащего углеводорода используют метиленхлорид при его объемной концентрации в смеси 20-50% а экстракцию проводят при перемешивании со скоростью 1200-1500 об/мин в течение 1-1,5 ч.

Способ обладает существенными отличиями, которыми являются замена хлороформа в составе экстрагента на метиленхлорид и проведение экстракции при перемешивании со скоростью 1200-1500 об/мин в течение 1-1,5 ч, что значительно увеличивает полноту извлечения ферментов из исходного сырья и позволяет снизить содержание примесных соединений, таких как белки плазмы, в экстракте. Метиленхлорид не обладает наркотическим действием и в 2,5 раза менее токсичен (ПДК 50 мг/м³), чем хлороформ, что позволяет улучшить условия труда людей при производстве фармакологических препаратов на основе супероксиддисмутазы и каталазы.

Способ заключается в том, что отмытые эритроциты крови лизируют добавлением равного объема дистиллированной воды в течение 16 ч при 4^оС, к полученному лизату добавляют охлажденную смесь этилового спирта и метиленхлорида при объемной концентрации последнего в смеси 20-50% (предпочтительно 40%) при соотношении объема лизата к объему экстрагента 1:(0,3-0,5) (предпочтительно 1: 0,4) и перемешивают в течение 1-1,5 ч со скоростью 1200-1500 об/мин при 0-4^оС. Из полученного экстракта далее известными способами могут быть выделены супероксиддисмутаза (СОД), каталаза (КТ), карбоангидраза (КБА).

П р и м е р 1. 5 л отмытых трижды физиологическим раствором эритроцитов крови человека лизируют добавлением равного объема дистиллированной воды в течение 16 ч при 4^оС. К полученному лизату добавляют охлажденную до 10-15^оС смесь 3,2 л этанола и 0,8 л метиленхлорида (20%) и перемешивают 30 мин со скоростью 1200 об/мин при 0-4^оС, разбавляют 1 л дистиллированной воды, перемешивают еще 30 мин в тех же условиях и центрифугируют при 2500 об/мин 15 мин, осадок отбрасывают. Получают 9,0 л экстракта, содержащего 170-180 тыс. Е СОД/л; 16-20 тыс. Е КТ/л; 600-700 тыс. Е КБА/л; 1,5-2,0 г гемоглобина/л; 0,02-0,10% плазматических белков.

П р и м е р 2. 5 л отмытых трижды физиологическим раствором эритроцитов крови человека лизируют добавлением равного объема дистиллированной воды в течение 16 ч при 4^оС. К полученному лизату добавляют охлажденную до 10-15^оС смесь 2,4 л этанола и 1,6 л метиленхлорида (40%) и перемешивают 40 мин со скоростью 1350 об/мин при 0-4^оС, разбавляют 1 л дистиллированной воды, перемешивают еще 40 мин в тех же условиях и центрифугируют при 2500 об/мин 15 мин, осадок отбрасывают. Получают 10,0 л экстракта, содержащего 190-200 тыс. Е СОД/л; 16-20 тыс. Е КТ/л; 600-700 тыс. Е КБА/л; 0,2-0,4 г гемоглобина/л; менее 0,02% плазматических белков.

П р и м е р 3. 5 л отмытых трижды физиологическим раствором эритроцитов крови человека лизируют добавлением равного объема дистиллированной воды в течение 16 ч при 4^оС.

К полученному лизату добавляют охлажденную до 10-15^оС смесь 2 л этанола и 2 л метиленхлорида (50%) и перемешивают 45 мин со скоростью 1500 об/мин при 0-4^оС, разбавляют 1 л дистиллированной воды, перемешивают еще 45 мин в тех же условиях и центрифугируют при 2500 об/мин 15 мин, осадок отбрасывают. Получают 10,0 л экстракта, содержащего 180-190 тыс. Е СОД/л; 12-16 тыс. Е КТ/л; 400-500 тыс. Е КБА/л; 0,2-0,4 г гемоглобина/л; 0,02-0,10% плазматических белков.

П р и м е р 4. 2 л отмытых трижды физиологическим раствором эритроцитов крови крупного рогатого скота лизируют добавлением равного объема дистиллированной воды в течение 16 ч при 4^оС. К полученному лизату добавляют охлажденную до 10^оС смесь 1 л этанола и 0,6 л метиленхлорида и перемешивают 40 мин со скоростью 1350 об/мин при 0-4^оС, разбавляют 0,4 л дистиллированной воды, перемешивают 40 мин и центрифугируют при 2500 об/мин 15 мин, осадок отбрасывают. Получают 4,0 л экстракта, содержащего 190-200 тыс. Е СОД/л; 16-20 тыс. Е КТ/л; 600-700 тыс. Е КБА/л; 0,2-0,4 г гемоглобина/л; менее 0,02% плазматических белков.

П р и м е р 5 (сравнительный). 5 л отмытых трижды физиологическим раствором эритроцитов крови человека лизируют добавлением равного объема дистиллированной воды в течение 16 ч при 4^оС. К полученному лизату добавляют охлажденную до 10-15^оС смесь 2,4 л этанола и 1,6 л хлороформа (40%), перемешивают на шуттель-аппарате с частотой 50-100 качаний/мин в течение 20 мин при 0-4^оС и центрифугируют при 2500 об/мин 15 мин, осадок отбрасывают. Получают 6,5 л экстракта, содержащего 90-100 тыс. Е СОД/л; 10-12 тыс. Е КТ/л; 400-500 тыс. Е КБА/л; 0,3-0,6 г гемоглобина/л; 0,08-0,32% плазматических белков.

Сравнительные характеристики экстрактов эритроцитов даны в таблице.

Предлагаемый способ позволяет с большим выходом и селективностью экстрагировать ферменты из эритроцитов. Это облегчает их последующую очистку известными способами и увеличивает выход конечных продуктов, что обеспечивает технологичность очистки ферментов, легкость ее реализации в крупномасштабном варианте.

Предлагаемый способ экстракции ферментов может быть использован в промышленных технологиях получения из утильных эритроцитов супероксиддисмутазы и каталазы, на основе которых предполагается создание отечественных лекарственных препаратов.

Изобретение может быть использовано в медицинской биохимии и энзимологии, энзимотерапии, а также в фармакологии для создания лекарственных препаратов. Сущность изобретения заключается в том, что экстракцию ферментов - супероксиддисмутазы, каталазы, карбоангидразы из лизированных эритроцитов осуществляют смесью галогеносодержащего углеводорода и этилового спирта, в качестве галогеносодержащего углеводорода и этилового спирта, в качестве галогеносодержащего углеводорода используют метиленхлорид при его объемной концентрации в смеси 20 - 50%, а экстракцию ведут при перемешивании со скоростью 1200 - 1500 об/мин, в течение 1 - 1,5 ч при 0 - 4^oС. Предлагаемый способ позволяет с большим выходом и селективностью экстрагировать ферменты из эритроцитов. Это облегчает их последующую очистку известными способами и увеличивает выход конечных продуктов, что обеспечивает технологичность очистки ферментов, легкость ее реализации в крупномасштабном варианте. Замена хлороформа на менее токсичный метиленхлорид позволяет улучшить условия труда людей при осуществлении способа. 1 табл.

СПОСОБ ЭКСТРАКЦИИ ФЕРМЕНТОВ ИЗ ЛИЗИРОВАННЫХ ЭРИТРОЦИТОВ смесью галогенсодержащего углеводорода и этилового спирта при перемешивании, отличающийся тем, что в качестве галогенсодержащего углеводорода используют метиленхлорид при его объемной концентрации в смеси 20 - 50%, а перемешивание ведут при скорости 1200 - 1500 об/мин в течение 1 - 1,5 ч.