ШТАММ БАКТЕРИЙ KLEBSIELLA PNEUMONIAE, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ КАК РЕФЕРЕНС-ШТАММ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ГЕМОЛИЗИНОВ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12N1/20 C12R1/22 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в качестве референс-штамма при определении признаков патогенности энтеробактерий, когда необходимо обоснование этиологической значимости культур, выделенных от больных ОКИ и объектов окружающей среды.

Известен штамм Staphylococcus aureus N 201050, одномоментно продуцирующий α- и β- гемолизины, наиболее часто используемый в лабораторных условиях для получения α-, β- гемолизинов и в качестве реферанс-штамма при изучении гемолитической активности микроорганизмов и выбранный нами за прототип (Каталог штаммов Всесоюзного музея патогенных бактерий/- М. 1982, c. 197).

Для получения целевого продукта штамм культивируют на жидких питательных средах, биомассу осаждают центрифугированием, а из надсадочной жидкости извлекают гемолизины. При изучении гемолитической активности штамм засевают на плотные питательные среды, содержащие эритроциты барана и кролика.

Недостатком известного штамма является то, что он относится к группе грамположительных микроорганизмов, что затрудняет его использование при изучении гемолитической активности штаммов грамотрицательных микроорганизмов и их гемолизинов.

Целью изобретения является получение нового высокоактивного штамма, продуцирующего одновременно α- и β- гемолизины.

Штамм Clebsielle pneuworiae выделен из клинического материала больного ОКИ, депонирован в коллекции Российского Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинский биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича под N 233.

Свойства штамма К.preumokiae-233.

Морфологические признаки. Грамотрицательные короткие палочки, неподвижные, жгутиков и спор не образуют. При окраске и тушевом препарате по Бурри выявлена капсула, диаметр которой составляет 1/2 диаметра тела бактериальной клетки.

Культуральные признаки. На мясопептонном бульоне через 3 ч дает легкое гомогенное помутнение, через 18-24 ч диффузный рост, с выраженными муаровыми волнами.

На мясопептонном агаре: светлые полупрозрачные колонии, с ровными гладкими краями, легко снимаются, диаметр 1,0-1,5 мм, признаков диссоциации нет. На среде Эндо: колонии бледно-розового цвета с более яркой точкой в центре при просмотре на свет, куполообразные, маслянистые, диаметр колоний 1,5-2,0 мм. Признаков диссоциации нет. На среде K₂: светлые полупрозрачные колонии, с легким желтоватым оттенком, маслянистые, диаметр колоний 1,0-1,5 мм. Признаков диссоциации нет.

Физиолого-биохимические признаки. Оптимум температурного роста (37±1)^oC; pH среды 7,0-7,2. Оптимальные условия аэробные. Активно расщепляет глюкозу и глицерин с образованием кислоты и газа, а также маннит, сахарозу, мальтозу, арабинозу, адонит, инозит, дульцит, ксилозу, сорбит, рамнозу, замедленно лактозу. Декарбоксилирует лизин, утилизирует малонат натрия и цитрат Козара, а также Симонса, обладает замедленной уреазной активностью, дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра, т.е. ферментирует глюкозу с образованием ацетил- метилкарбинола (ацетоина). Не образует сероводород и индол, в реакции метил-рот отрицательна. Орнигиндекарбоксилаза, эргининдегидролаза и фенилаланиндезаминаза отсутствует. Штамм неподвижен.

Антигенная структура штамма при серотипировании набором сывороток ЦНИИВиС им. Мечникова не установлена.

Чувствительность к антибактериальным препаратам. Исследованиями методом серийных разведений установлена чувствительность и следующим препаратам: неомицину (10 мг/мл), канамицину (5 мгк/мл), гентамицину 82,5 (мгк/мл), сизомицину (1 мкг/мл), кефзолу (5 мкг/мл), клафорану (25 мкг/мл), левомицетину (10 мгк/мм), полимиксину В (5 мгк/мл), налидиксовой кислоте (10 мгк/мм). Устойчив к бензилпенициллину (10 мгк/мм), ампициллину (1,5 мгк/мм), ампиоксу (1,5 мгк/мм), тетрациклину (50 мгк/мм), эритромицину (250 мгк/мм.).

Биологические свойства. Штамм обладает способностью стабильно продуцировать α- и β- гемолизины.

Вирулентные свойства: LD₅₀ для белых мышей 2 • 10⁹ м.т.

Штамм используют следующим образом:
Пример 1. Суточную культуру штамма К. precruoniae 233 рассеивают методом истощения петли на чашки Петри с мясопептонным агаром, содержащим 5%-ную дефибринированную кровь барана и выдерживают при температуре (37±)^oC в течение 18-24 ч. По истечении указанного срока производят учет. Зона лизиса вокруг колоний составляет 2-3 мм. Чашки выдерживают при температуре (6±4)^oC в течение 2-6 ч и вновь измеряют зону лизиса, которая составляет 4-6 мм. Таким образом штамм продуцирует β гемолизины.

Пример 2. Суточную культуру штамма К.preuruopicie 233 рассеивают методом истощения петли на чашки Петри с мясопептонным агаром, содержащим 5%-ную дефибринированную кровь кролика и выдерживают при температуре (37±1)^oC в течение 18-24ч, затем учитывают. Зона лизиса вокруг колоний составляет 2-3 мм. Чашки выдерживают при температуре (6±4)^oC 2-6 ч. После чего вновь измеряют зону лизиса, она составляет 5-6 мм, что свидетельствует о продукции a гемолизина.

Пример 3. Культуру штамма К.preuworicee 233 засевают в пробирку с 5 мл мясопептонного бульона, pH 7,0-7,2 и выращивают при температуре (37 ±1)^oC в течение 6 ч при непрерывном перемешивании на шуттель-аппарате. Полученный таким образом инокулят вносят во флаконы объемом 0,5 л со 100 мл мясопептонного бульона. Флаконы помещают в шуттель-аппарате роторного типа (60 циклов в мин, шаг платформы 40-45 мин) и культивируют при температуре (37 ±1)^oC в течение 18-20 ч. По окончании культивирования культуру инактивируют азидом натрия 1:10000. Биомассу осаждают центрифугированием при 5000 об/мин в течении 25-30 мин, осадок ресуспендируют в 25 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия и дезинтегрируют на УЗДН при 5 мА в течение 10 мин. Обломки осаждают центрифугирвоанием при 12000 об/мл в течение 30-40 мин. Супернатант, представляющий собой лизат бактериальных клеток, подвергают исследованию.

В один ряд лунок титровальных планшетов вносят по 1 мл 3%-ной взвеси отмытых в 0,9%-ном растворе хлорида натрия нативных эритроцитов кролика, во второй ряд эритроциты барана. Затем вносят по 0,1 мл, предварительно раститрованного двушаговым разведением в 0,9%-ном растворе хлорида натрия лизата бактериальных клеток (1:2-1-256). Планшет закрывают стеклом и выдерживают при температуре (37 ±)^oC 1 ч, затем при температуре 2-10^oC в течение 2-4 ч. Учитывает результаты. Полный гемолиз эритроцитов барана наблюдали при внесении в лунки лизата бактериальных клеток в разведении 1:128; полный гемолиз эритроцитов кролика при разведении супернатанта 1:64.

Таким образом, штамм интенсивно продуцирует a- и β гемолизины.

Пример 4. Культуру штамма К. preuruoniae 233 выращивают и получают лизат бактериальных клеток, как описано в примере 3.

В агаре, содержащем 5%-ную взвесь эритроцитов кролика и барана, пробивают ряд лунок диаметром 4 мм и вносят по 25 мкл лизата бактериальных клеток, раститрованных двушаговым разведением, как описано в примере 3, и помещают во влажную камеру при температуре (37± 1)^oC на 4-6 ч, затем на 2-4 ч при температуре 2-10^oC. Вокруг лунок наблюдают гемолиз эритроцитов. Диаметр зоны эритроцитов барана и кролика 6-8 мм наблюдают при разведении лизата бактериальных клеток 1:16-1:32, что свидетельствует о наличии a- и β - гемолизина.

Пример 5. Изучение способности штамма К.prueruorisee 233 стабильно продуцировать a- и β -гемолизацин проводят следующим образом: штамм хранят на полужидком голодном агаре под слоем вазелинового масла при температуре (6± 4)^oC и лиофилизированный. Через каждые 4-8 мес подвергают исследованию, как описано в примере 1 и 2.

Данные, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что штамм К. preuruoricee не утратил свойства к продукции a- и β- гемолизинов при различных условиях хранения в течение 2,5 лет.

Штамм К. preuruoricee 233 обладает стабильной способностью к продукции α- и β- гемолизина и может быть использован в качестве референс-штамма при изучении гемолитической активности штаммов, выделенных от больных, объектах окружающей среды и других источников, когда необходима дифференциация патогенных и непатогенных штаммов.

Использование: микробиология, биотехнология, референс-штамм, гемолизин, энтеробактерии. Сущность изобретения: предложен штамм Klebsiella pneumonike ГИСК N 233 для определения гемолитической активности энтеробактерий. Штамм обладает стабильной способностью продуцировать α- и β- гемолизины, вызывая лизис эритроцитов барана и кролика. Гемолитическую активность определяют путем посева штамма на питательную среду, содержащую эритроциты барана и кролика с последующей инкубацией при температуре 36-38^oC в течение 18-24 ч. Наличие зон лизиса свидетельствует о продукции гемолизинов. Штамм может быть использован в качестве реферанс-штамма при излучении гемолитической активности штаммов, выделенных от больных, объектах окружающей среды и других источников, когда необходима дифференциация патогенных и непатогенных штаммов. 1 табл.

Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae ГИСК N 233, используемый в качестве рефененс-штамма при определении альфа-, бета- гемолитической активности штаммов энтеробактерий.