ШТАММ БАКТЕРИЙ KLEBSIELLA PNEUMONIAE 232 - ПРОДУЦЕНТ β -ГЕМОЛИЗИНА Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 C12P1/04 C12N1/20 C12R1/22 

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, а именно к биотехнологии, и может быть использовано в технологическом процессе производства β-гемолизина для получения диагностических препаратов, а также в качестве референс-штамма при изучении b-гемолитической активности штаммов.

Цель изобретения создание штамма, стабильно продуцирующего b-гемолизин, использование которого упрощает способ получения b-гемолизина как антигенного препарата.

Штамм Klebsiella pneumoniae выделен из клинического материала больной диареей, депонирован в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича под N 232.

Характеристика штамма. Культурально-морфологические признаки: окраска по Граму: грамотрицательные палочки с закругленными концами. Спор не образуют.

Окраска в тушевом препарате по Бурри: грамотрицательные мелкие палочки с четко выраженной капсулой, размер которой достигает 1/2 диаметра тела бактериальной клетки.

Рост на среде Эндо: ярко-розовые колонии с более темной окраской в центре, выпуклые, маслянистые, диаметр колоний 1,5-2,0 мм. Признаков диссоциации нет.

Рост на среде K₂: колонии светло-желтого цвета, маслянистые, диаметр колоний 2-3 мм, высокие с ровными краями. Признаков диссоциации нет.

Рост на мясо-пептонном агаре: колонии светлые, полупрозрачные, маслянистые с ровными краями, диаметр 1,0-1,5 мм. Признаков диссоциации нет.

Рост на мясо-пептонном бульоне: вызывают равномерное помутнение среды, при легком покачивании дробирки появления муаровых волн.

Физиолого-биохимические признаки: оптимум роста при температуре (37±1)^oC, оптимум pH среды 7,0-7,2, оптимальные условия аэробные. Активно расщепляет глюкозу и глицерин с образованием кислоты и газа, а также расщепляет лактозу, манит, сахарозу, мальтозу, арабинозу, адонит, инозит, дульцит, ксилозу, сорбит, рамнозу. Обладает уреазной активностью. Дает положительную реакцию на индол и Фогес-Проскауэра. Утилизирует цитрат Симонса, цитрат Козера и малонат натрия. Дает отрицательную реакцию на сероводород и метил-рот. Присутствует лизиндекарбоксилаза. Орнитиндекарбоксилаза и аргининдегидролаза отсутствуют.

Штамм K. pneumoniae 232 нетипируемый. Серотипирование проводят набором K^- сывороток УНИВиС или Мечникова.

Чувствительность к антибактериальным препаратам.

Устойчивость к антибиотикам определяют методом серийных разведений.

Установлено, что штамм устойчив к бензилпенициллину (10 мкг/мл) ампициллину (1,5 мкг/мл), ампиоксу (1,5 мкг/мл), тетрациклину (1,5 мкг/мл), доксициллину (30 мкг/мл).

Штамм чувствителен к неомицину (1,0 мкг/мл), канамицину (5,0 мкг/мл), гентамицину (2,5 мкг/мл), сизомицину (1,0 мкг/мл), кефзолу (1,0 мкг/мл), клафорану (1,0 мкг/мл), цефалотину (1,5 мкг/мл), а также к левомицитину (5 мкг/мл), полимиксину (2,5 мкг/мл), налидиксовой кислоте (25 мкг/мл) и триметоприму (25 мкг/мл).

Активность штамма
Интенсивность продукции b-гемолизина определяют по зоне просветления питательной среды, содержащей эритроциты через 18-24 ч выращивания при температуре (37±1)^oC. Зона лизиса составляет 4-5 мм. Штамм лизирует эритроциты барана.

Вирулентность на модели белой мыши: LD₅₀ 2•10⁹ м.т.

Штамм используют следующим образом.

Пример 1. Культуру штамма засевают методом истощения петли в чашки Петри с мясо-пептонным агаром, содержащим 5 взвесь эритроцитов барана. Чашку Петри выдерживают при температуре (37±1)^oC в течение 18-24 ч. По истечение указанного срока производят учет. Зона просветления составляет 3-4 мм. Затем чашку Петри с посевами выдерживают при температуре (6±4)^oC 2-3 ч и вновь учитывают, зона просветления составляет 5-6 мм вокруг каждой колонии.

Пример 2. Культуру штамма засевают на скошенный мясо-пептонный агар и выращивают при температуре (37±1)^oC в течение 18-24 ч и смывают 5 мл стерильного физиологического раствора. Из полученного смыва культуры с помощью стандарта готовят взвесь 10⁹ м. т. /мл, 0,5•10⁹ м.т./мл, 1•10⁸ м.т./мл; 0,5•10⁸ м.т./мл; 1•10⁷ м.т./мл; 0,5•10⁷ м.т./мл.

Из отмытых физиологическим раствором бараньих эритроцитов готовят 3 взвесь и вносят по 1 мл ряд лунок титровальных планшетов. Затем последовательно вносят по 1 мл раститрованной двушаговым разведением культуру. Планшет закрывают стеклом и выдерживают при температуре (37±1)^oC в течение 1 ч. По истечении указанного срока учитывают. Полный гемолиз эритроцитов барана наблюдают при концентрации культуры 1•10⁷ м.т./мл.

Пример 3. Смыв суточной агаровой культуры получают, как описано в примере 2, и подвергают ультразвуковой дезинтеграции при амплитуде 15-16 кГц в течение 7-10 мин при температуре минус 1-0^oC. Обломки бактериальных клеток осаждают центрифугированием при 8000 об/мин в течение 30 мин при температуре (6±4)^oC. Супернатант подвергают исследованию, предварительно раститровывают его в физиологическом растворе двушаговым разведением 1:2, 1:4 и т.д. до 1: 128.

В агаре, содержащем 5% взвесь эритроцитов барана, пробивают лунки диаметром 4 мм и вносят по 25-30 мкл раститрованного супернатанта и выдерживают при комнатной температуре 4-6 ч. Зона лизиса в разведении 1:64 составляет 5-6 мм.

Пример 4. Изучение способности штамма K. pneumoniae 232 стабильно продуцировать b-гемолизины проводили следующим образом: штамм хранят на полужидком голодном агаре под слоем вазелинового масла при температуре (6±4)^oC и лиофильно-высушенный, через каждые 6 мес. подвергают исследованию, как описано в примере 1.

Как видно из данных таблицы, штамм K. pneumoniae N 232 обладает способностью продуцировать b-гемолизин.

Таким образом, штамм K. pneumoniae N 232 является стабильным продуцентом b-гемолизина, что может быть использовано в производстве гемолизина как антигена, необходимого для получения диагностических препаратов, а также в качестве референс-штамма при изучении гемолитических свойств культур клебсиелл и других энтеробактерий.

Использование: микробиология, биотехнология, клебсиелла, гемолизин. Сущность изобретения: новый штамм бактерий Klebsiella pneumoniae, обладающий стабильным свойством продуцировать b-гемолизин. Штамм выделен от больного диареей, штамм не типируется. Штамм депонирован под N 232 в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича. Штамм Klebsiella pneumoniae ГИСК N 232 может быть использован для получения диагностических препаратов, а также в качестве референс-штамма при изучении b-гемолитической активности штаммов. 1 табл.

Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae ГИСК N 232 продуцент β - гемолизина.