ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ Российский патент 1996 года по МПК C12N5/00 C12N7/00 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к выращиванию клеток человека и животных, и может быть использовано при культивировании вирусов, производстве вакцин, получении моноклональных антител, проведении диагностических исследований.

Известны стандартные ростовые питательные среды для культивирования человека и животных [1] Однако эти среды не обеспечивают выход достаточного количества целевого продукта.

Задача изобретения обеспечить существенное повышение выхода клеточной продукции.

Для этого в стандартную ростовую питательную среду среда Игла, Игла-МЕМ, среда 199 кроме стандартных добавок (сыворотка крупного рогатого скота в конечной концентрации 8-10% антибиотики) вводят 5 α -фуростан-3 β, 22, 26-триол-3-[0- β -D-глюкопиранозил (1 __→ 2)- β -D-глюкопиранозил (1 __→ 4)- β -D-галактопиранозид] -26-0- β D-глюкопиранозид в концентрации 0,01% (Sato H. Sakamura S. A better Principle of tomato Seeds Isolation and structure of new Furactanol Saponin. -Agr.Biol.Chem. 1973, 37(2), p.225-231.

На предлагаемой питательной среде количество клеточной популяции увеличивается в 3 и более раз по сравнению с известными средами.

П р и м е р 1. Приготовление первично-трипсинированной культуры фибробластов эмбриона человека (ФЭЧ). Ткани туловища и конечностей плода 2-4-месячной беременности измельчают ножницами до мелких кусочков, размером 2-4 мм, затем промывают три раза в растворе Хенкса рН 7,4. Измельченную ткань трипсинизируют. Полученную суспензию клеток осаждают центрифугированием при 1500-2000 об/мин в течение 15 мин и помещают в холодильник до смешивания с клетками последующих экстракций. Смешанную суспензию клеток, полученную после всех экстракций, центрифугируют при 1500-2000 об/мин в течение 15 мин, надосадочную жидкость отбрасывают, клетки ресуспендируют в среде с 0,5%-ным раствором гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса рН 7,0. Осадок ресуспендируют в питательной среде для выращивания клеток до концентрации 200 тыс. клеток в 1,0 мл ростовой среды. В качестве среды для выращивания клеток используют среду с 0,5% гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса рН 7,0; среду 199 на растворе Хенкса рН 7,2; в каждую из которых добавляют сыворотку крупного рогатого скота (10,0%) и антибиотики из расчета 25 тыс.ед. пенициллина и 25,0 мг стрептомицина на 100,0 мл среды. Клеточную суспензию разделяют на две половины, в одну из них помимо вышеперечисленных ингредиентов добавляют 10,0% -ный раствор 5 α -фуростан-3 β22,26-триол-3-[0- β -D- глю- копиранозил (1 __→ 2) β D глюкопиранозил (1 __→ 4)β D-галактопиранозид]-26-0- β -D-глюкопиранозид, предварительно приготовленный на среде 199 и простерилизованный через пластины Millipore с диаметром пор 0,22 мкм с таким расчетом, чтобы конечная концентрация биостимулятора в ростовой среде составила 0,01% Первично трипсинизированные клетки фибробластов эмбриона человека разливают в пробирки по 1,0 мл. Пробирки укладывают в штатив под углом 30-40^о и помещают в термостат при 37^оС. Через 3 суток культивирования клеток (в присутствии биостимулятора) формируется монослой клеток типичной морфологии.

Вторую половину клеточной суспензии, куда не добавляют биостимулятор, используют в качестве контроля. Затем приступают к подсчету клеток. Для этого клетки снимают со стекла смесью, состоящей из равных объемов 0,25%-ных растворов трипсина и версена, предварительно подогретой на водяной бане до 30-35^оС. Выливают из пробирок ростовую среду, клеточный монослой промывают 3 раза фосфатно-буферным раствором, рН 7,5. Затем теплой смесью трипсин-версена заливают монослой культуры клеток так, чтобы все участки были покрыты жидкостью. Пробирки встряхивают и помещают в термостат (37^оС) на 15-20 мин до полного отделения клеток от поверхности стекла. Суспензию клеток центрифугируют 10 мин при 2000-2500 об/мин, смесь трипсин-версен удаляют. Осаждение центрифугированием клетки ресуспендируют в 1,0 мл питательной среды, количество клеток подсчитывают в счетной камере Горяева. Количество фибробластов эмбриона человека при использовании ростовой питательной среды, содержащей помимо известных добавок и биостимулятор (0,01% ), составляет 6,8·10⁵; 12,2·10⁵ и 28,3·10⁵ кл/мл, в то время как в контроле эти показатели составляют 3,5·10⁵; 4,2·10⁵ и 9,4·10⁵ кл/мл спустя 24, 48 и 72 ч соответственно см. таблицу.

П р и м е р 2. Приготовление перевиваемой культуры НЕр-2.

Взвесь клеток контролируют на бактериальную стерильность, разводят питательной средой (среда 199, среда Игла и др.) с таким расчетом, чтобы в 1,0 мл содержалось 90 тыс. клеток. В качестве среды для выращивания клеток используют среду Игла, среду 199, Игла-МЕМ с добавлением сыворотку крупного рогатого скота и антибиотиков из расчета 25 тыс. единиц пенициллина и 25,0 мг стрептомицина на 100,0 мл среды. Как и в предыдущем опыте клеточную суспензию разделяют на две половины, в одну из которых помимо ростовой среды добавляют 10,0% стерильного раствора с таким расчетом, чтобы конечная концентрация биостимулятора 5 α -фуростан-3 β,22,26-триол-3-[0- β -D-глюкопиранозил (1 __→ 2)- β -D-глюкопиранозил (1 __→ 4)- β -D-галактопиранозид]-26-0- β -D-глюкоопиранозида составила 0,01% Перевиваемую культуру клеток НЕр-2 разливают в пробирки по 1,0 мл. Пробирки укладывают в штатив под углом 30-40^о и помещают в термостат при 37^оС. Клетки снимают с поверхности стекла матраса раствором, состоящим из равных объемов трипсина и версена. После добавления протеолитических ферментов пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37^оС на 15-20 мин, до полного отделения клеток от поверхности стекла. После осаждения клеток центрифугированием их ресуспендируют в 1 мл питательной среды, количество клеток подсчитывают в счетной камере Горяева. Количество клеток НЕр-2 при использовании ростовой среды (среда Игла, содержащая 8,0% сыворотки крупного рогатого скота) с добавлением биостимулятора в конечной концентрации 0,01% составляет 1,1·10⁵; 4,0·10⁵; 14,3·10⁵ кл/мл, в то время, как при использовании среды без стимулятора 0,9·10⁵; 1,4·10⁵; 5,4·10⁵ кл/мл спустя 24,48 и 72 ч соответственно.

Питательная среда, представленная в новом составе и используемая для выращивания клеток, позволяет значительно увеличить выход целевого продукта. Количество клеток увеличивается в 3 и более раз.

Использование: культивирование клеток человека и животных, необходимых для получения вакцинных штаммов вирусов и проведения диагностических исследований. Сущность: получение питательной среды для культивирования клеток, содержащей триозид-(25 S)-5 α=3β, 22 α, 26-триол-26-0- β -Д-глюкопиранозид. Триозид получают путем экстракции семян томатов 70%-ным метанолом. При его добавлении в стандартную ростовую среду выход клеток увеличивается не менее, чем в 2 раза. 1 табл.

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ, представляющая собой стандартную ростовую среду с добавлением сыворотки крупного рогатого скота, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит 5α-фуростан-3, b22, 26- триол-3[ 0- β -D-глюкопиранозил (1_→2-β-D-глюкопиранозил (1_→4)-β-D-галактопиранозид ]-26-0- b-D-глюкопиранозид в концентрации 0,01%.