ИНГИБИТОР РОТАВИРУСОВ Российский патент 1995 года по МПК C12N7/06 

Изобретение относится к медицинской и ветеринарной вирусологии, а именно к средству для инактивации вирусов человека и животных.

Задача изобретения расширение ассортимента ингибиторов ротавирусов.

Для осуществления этого в качестве ингибитора ротавирусов.

Для осуществления этого в качестве ингибитора ротавирусов используют раствор капсикозида 3-0-[β-D-глюкопиранозил-(1 _→2)-β-D-глюкопиранозил (1_→3)-β -D-Glc_p (1_→4)- β-D-Gal_p(1_→3)-β-D-Glc_p-[(2s-R)-5 α-фурастан-2α 3β22α26-тетраол]-26-0-β-D-Glc_p [1]
Капсикозид представляет собой порошкообразное кристаллическое вещество желто-коричневого цвета, устойчивое к действию света, гигроскопическое, срок хранения в герметической упаковке при комнатной температуре 5 лет, растворимое в воде. Препарат, являясь вторичным метаболитом высших растений, не обладает цито- и фитотоксичностью. Препарат 3-0-[ β-D-глюкопиранозил-(1_→2)β- D-глюкопиранозил (1_→3)-β-D-Glc_p (1_→4)-β-D-Gal_p (1-3- β-D-Glc_p] -[(2s-R)-5α-фурастан-2α, 3β, 22α, 26-тетра-ол] -26-0-β-D-Glc_pполучают путем экстракции семян перца 70,0% метанолом. Экстракт упаривают досуха и многократно хроматографируют на колонке с силикогелем [2]
Инактивацию вируссодержащего материала проводят путем добавления капсикозида в конечной концентрации 0,005% и выше. Затем смесь выдерживают при комнатной температуре (18-22^оС) в течение 1 ч и более. Проявление антивирусного действия препарата выявляют при определении инфекционности вируса в культуре клеток.

Противовирусное действие препарата демонстрирует следующий пример.

В отделении емкости с питьевой водой (предварительно проконтролированной на отсутствие в ней вирусов) вносят обезьяний вирус SA-11, адаптированный к росту в перевиваемой культуре СПЭВ, в разных дозах, и добавляют 200,0; 100,0; 50,0; 25,0 мг капсикозида. Смеси экспонируют в течение 1 ч при комнатной температуре (22^оС). Проявление вирулицидного действия препарата контролируют по исчезновению инфекционности вируса в культуре клеток СПЭВ, пермиссивных для их репродукции.

Ингибитор. Используют стероидный гликозид капсикозид, представляющий собой порошкообразное, кристаллическое вещество белого с желтым оттенком цвета, растворимое в воде, не обладающее цито- и фитотоксичностью.

Приготовление перевиваемой культуры СПЭВ. Перед посевом культуры проводят просмотр и оценку монослоя. Отбирают культуру со сплошным монослоем клеток, имеющим типичную для данной линии морфологию, с четко выраженными границами между клеток. Клетки снимают со стекла матрасов трипсин-версеном. Для этого готовят смесь равных объемов 0,25%-ных раствором трипсина и версена, подогревают ее в водяной бане до 35^оС. Вначале с матрасов выливают питательную среду, клеточный монослой промывают 3 раза фосфатно-буферным раствором (рН 7,5), не содержащим ионы кальция и магния. Затем теплой смесью трипсин-версена заливают монослой культуры клеток как, чтобы все участки были покрыты жидкостью. В матрасы, объемом 100,0; 250,0 и 1000,0 мл раствор добавляют соответственно по 10,0; 15,0 и 30,0 мл. Матрасы встряхивают и помещают в термостат (37^оС) на 15-20 мин до полного отделения клеток от поверхности стекла. Крупные конгломераты клеток диспергируют, пипетируя несколько раз клеточную взвесь. Суспензию клеток центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин, смесь трипсин-версен удаляют. Осажденные центрифугированием клетки культуры СПЭВ ресуспендируют в небольшом объеме ростовой питательной среды, количество клеток подсчитывают в счетной камере Горяева. Взвесь клеток контролируют на бактериальную стерильность, разводят питательной средой с таким расчетом, чтобы в 1,0 мл содержалось 90 тыс. клеток. В качестве среды для выраживания клеток культуры СПЭВ используют среду Игла-МЕМ или среду Игла с 10,0% сыворотки крупного рогатого скота и с антибиотиками из расчета 25 тыс. ЕД пенициллина и 25,0 мг стрептомицина на 100,0 мл среды. Перевиваемую культуру СПЭВ разливают в пробирки по 1,0 мл. В качестве поддерживающей среды используют те же питательные среды без добавления сыворотки. Обновление сплошного монослоя клеток новой генерации наблюдают через 4-5 сут.

Титрование вируса. Количественное определение ротавируса SA-II проводят в культуре клеток СПЭВ методом конечного разведения по цитопатогенному действию и выражают в lg ЦПД₅₀/мл. Для титрования ротавируса SA-II вначале готовят его разведения, обычно десятикратные, от 10^-1 до 10^-8. Во все пробирки вносят по 9,0 мл стерильного физиологического раствора или раствора Хенкса. Затем в первую пробирку вносят 1,0 мл вируссодержащего материала и получают разведение 10^-1(1:10). При помощи новой пипетки содержимое первой пробирки тщательно перемешивают и 1,0 мл переносят во вторую пробирку, получая разведение 10^-2 (1:100) и т.д. до 10^-8.

Предварительно перед заражением монослоя культуры СПЭВ вирусом SA-II производят трехкратное промывание культуры клеток от сыворотки раствором Хенкса, рН 7,4 или раствором Эрла, рН 7,6. На каждое десятикратное разведение вируссодержащего материала используют по 4 пробирки с культурой клеток. Вируссодержащий материал в объеме 0,2 мл вносят в пробирки с культурой клеток, адсорбцию проводят 1 ч при температуре 37^оС, затем добавляют поддерживающую среду в объеме 0,8 мл, содержащую трипсин в конечном концентрации 20,0 мкг/мл и инкубируют при 37^оС. Пробирки помещают в термостат с специальных лотках в горизонтальном положении. Состояние зараженной культуры периодически проверяют под световым микроскопом в течение 7 дней. Результат цитопатического действия ЦПД₅₀ вируса считают положительным, если не менее половины клеток в культуре подвергались специфической дегенерации. Титр (50,0% эффективной дозы) вычисляют методом конечного разведения (лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний. /Под ред. проф. Леннета Э. и Шмидта Н. М. Медицина, с. 5-56. Ворошилова М.К. Жевандрова В.И. Балоян М.С. Методы лабораторной диагностики энтеровирусных инфекций. М. Медицина 1964, 150 с. и методом пробитов, используя специальные таблицы (Методические рекомендации по санитарно-вирусологическому контролю объектов окружающей среды./ Под ред. проф. Дроздова С.Г. и Казанцевой В.А. М. 1982, 76 с.).

Внесение ротавируса и капсикозида в воду. В 100,0 мл воды, свободной от вирусов, вносят ротавирус SA-II в дозах (в объеме 10,0 мл вируссодержащей суспензии) 1 х x10⁵; 1 х 10⁶; 1 х 10⁷ ЦПД₅₀. На каждую дозу вируса используют по 6 емкостей с питьевой водой. В емкости под NN 1-4 вносят капсикозид в количестве 200,0; 100,0; 50,0 и 25,0 мг соответственно. Пятую и шестую емкости используют в качестве контроля, в пятую емкость вносят только вирус, а в последнюю (шестую) никаких ингредиентов не добавляют. Все емкости выдерживают 1 ч при комнатной температуре (22^оС).

Определение вирулицидной активности томатозида по остаточному количеству вируса в воде. Спустя 1 ч после внесения стероидного гликозида в воду, где предварительно был внесен ротавирус SA-II, методом конечного разведения по цитопатическому эффекту определяют остаточное количество вируса. Для этого пробы воды, куда были внесены различные дозы капсикозида, а также образцы пробы воды, куда был внесен только вирус SA-II в объеме 2,0 мл, фильтруют через пластины "Millipore" c диаметром пор 0,22 мкм с целью исключения бактериальной контаминации. Количество вируса в воде, обработанной и не обработанной капсикозидом, определяют методом конечного разведения по ЦПД₅₀ по вышеописанной методике. Для определения остаточного вируса (включая контроль) готовят десятикратные разведения от 10^-1 до 10^-8. На каждое десятикратное разведение вируссодержащего материала используют по четыре пробирки с культурой клеток. Затем вируссодержащий материал вносят на монослой перевиваемой культуры СПЭВ в объеме 0,2 мл, инкубируют при 37^оС в течение 1 ч, после чего жидкость удаляют и вносят поддерживающую среду в объеме 0,8 мл, содержащую трипсин в концентрации 20,0 мкг/мл. После этой процедуры инкубирование культур периодически проверяют под световым микроскопом в течение 7 дней.

Опыт сопровождается следующими контролями.

1. Контроль интактной культуры клеток СПЭВ без добавления в поддерживающую среду капсикозида. Поддерживающая среда содержит только 20,0 мкг/мл трипсина и антибиотиков.

2. Контроль интактной культуры клеток СПЭВ при наличии трипсина и капсикозида в поддерживающей среде. Последний в концентрации 0,02; 0,01; 0,005 и 0,0024%
3. Контроль за состоянием монослоя культуры клеток СПЭВ, на который была внесена проба воды, не содержащей ни вирус, ни капсикозид. Поддерживающая среда содержит трипсин и антибиотики в вышеуказанных концентрациях.

4. Контроль за остаточными количеством вируса в питьевой воде, куда был внесен только вирус SA-II. Поддерживающая среда содержит трипсин (20,0 мкг/мл) и антибиотики.

Степень дегенерации монослоя культуры СПЭВ оценивают по четырехбальной системе: 4+ деструкция всех клеток в пробирке; 3+ большей части клеток; 2+ половины клеток; 1+ меньше половины клеток. Отсутствие цитопатогенного действия вируса SA-II обозначают знаком "-". Результаты цитопатогенного действия вируса SA-II считают положительным, если не менее половины клеток в культуре СПЭВ подвергается специфической дегенерации. Специфичность дегенерации монослоя клеток СПЭВ также проверяют в реакции РНГА и ИФА. Для первого теста используют диагностикум эритроцитарный ротавирусный иммуноглобулиновый, научно-производственного объединения "Ростэпидкомплекс", для второго тест-систему для детекции ротавирусного антигена, разработанную в НИИ микробиологии и эпидемиологии им. Л. Пастера.

Учет цитопатогенного действия вируса проводят, как указано выше, при соблюдении вышеперечисленных контролей отсутствии каких-либо цитоморфологических, дегенераторных изменений в монослое интактной культуры клеток СПЭВ при наличии и отсутствии капсикозида в поддерживающей среде; наличии инфекционного вируса в образцах проб воды, куда вносят только вирус, и отсутствии цитопатогенного действия вируса в монослое культуры клеток, куда не вносили ни вирус, ни стероидный гликозид. Достоверность результатов определения вирулицидной активности капсикозида на модели ротавируса SA-II оценивают по значимости индекса нейтрализации активности инфекционности вируса.

Анализ результатов. Определение количества ротавируса SA-II, внесенного в дозах 1 х 10⁵; 1 х 10⁶; 1 х 10⁷ ЦПД₅₀ в питьевую воду, не обработанную капсикозидом, после 1 ч экспозиции при комнатной температуре (22^оС) показало, что оно составляет 2,6; 3,7 и 4,6 lg ЦПД₅₀/мл, соответственно (табл.1, 2). Вместе с тем не удалось определить количество вируса, внесенного в дозах 1 х 10⁵ и 1 х 10⁶ ЦПД₅₀ в питьевую воду, обработанную капсикозидом в конечной концентрации 0,01 и 0,02% при том же режиме экспозиции. При увеличении дозы внесенного вируса в питьевой воде до 1 х 1,7 ЦПД₅₀ на 100,0 мл воды, содержащей капсикозид в вышеуказанных концентрациях, удалось установить, что незначительная часть вируса инактивируется (табл.3). Изучение антивирусной активности капсикозида в концентрации 0,005 и 0,002% показало, что в первом случае она еще частично сохраняется (индекс нейтрализации инфекционной активности вируса SA-II составил 10), во втором она практически отсутствует. Об этом также свидетельствует значение индекса нейтрализации (0) при конечной концентрации капсикозида в питательной среде 0,0024%
Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о значительной антивирусной активности капсикозида по отношению к ротавирусам (в частности против вируса SA-II), ранее не описанным в литературе.

Использование: изобретение относится к медицинской и ветеринарной вирусологии и касается инактивации ротавирусов человека и животных. Сущность изобретения: для инактивации ротавирусов применяют капсикозид. Инактивацию вируссодержащего материала проводят путем добавления капсикозида в конечной концентрации 0,005% и выше и смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 60 мин и более. Проявление вирулицидного действия препарата контролируют по исчезновению инфекционности вируса в культуре клеток СПЭВ. 3 табл.

Применение капсикозида в качестве ингибитора ротавирусов.