ИНГИБИТОР ЭНТЕРОВИРУСОВ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ Российский патент 1995 года по МПК C12N7/04 

Изобретение относится к медицинской вирусологии, а именно к средству для инактивации вирусов человека и животных. Известно использование томатозида в качестве химического иммунизатора для защиты растений табака от вируса бронзовости табака (ВБТ) [1].

Целью изобретения является расширение ассортимента ингибиторов вирусов человека и животных in vitro.

Для достижения цели в качестве ингибитора вирусов человека и животных используют раствор томатозида.

Томатозид представляет собой порошкообразное кристаллическое вещество желто-коричневого цвета, устойчивое к действию света, гигроскопичное, срок хранения в герметичной упаковке при комнатной температуре 5 лет, растворим в воде. Препарат, являясь вторичным метаболитом высших растений, не обладает цито- и фитотоксичносью [2].

Для использования томатозида в качестве ингибитора вирусов человека и животных препарат добавляют к среде с таким расчетом, чтобы конечная концентрация составила не меньше 0,05%, которая среди испытанных (0,1; 0,05; 0,025; 0,0125; 0,00625) оказалась наиболее эффективной.

Инактивацию вируссодержащего материала, находящегося в безбелковых средах, проводят путем добавления томатозида в концентрации 0,05% и выше. Затем смесь выдерживают при комнатной при комнатной температуре (18-22^оС) в течение 1 ч и более. При этом проявляется вирулицидное действие, которое контролируется по исчезновению инфекционности вируса в культуре клеток.

Противовирусное действие препарата демонстрирует следующий пример.

В отдельные емкости с питьевой водой (предварительно проконтролированной на отсутствие в нем вирусов) вносят дикий вирус полиомиелита типа I (штамм Луговской) в разных дозах (табл.1), добавляют 100,0. 50,0; 25,0; 12,5; 6.25 мг томатозида. Смеси экспонируют в течение 1 ч при комнатной температуре (19-22^оС). Проявление вирулицидного действия контролируют по исчезновению инфекционности вирусов в культуре клеток, пермиссивных для их репродукции.

Ингибитор. Используют стероидный гликозид - томатозид, представляющий собой порошкообразное, кристаллическое вещество, белого с желтым оттенком цвета, растворимое в воде, не обладающее цито- и фитоксичностью.

Приготовление перевиваемой культуры НЕр-2. Перед посевом культуры проводят просмотр и оценку монослоя. Отбирают культуру со сплошным монослоем клеток, имеющих типичную для данной линии морфологию, с четном выраженными границами между клеток. Клетки снимают со стекла матрасов трипсин-версеном. Для этого приготавливают смесь равных объемов 0,25% растворов трипсина и версена, подогревают ее в водной бане до 30-35^оС. В начале с матраса выливают питательную среду, клеточный монослой промывают 3 раза фосфатно-буферным раствором (рН 7,5), не содержащем ионы кальция и магния. Затем теплой смесью трипсин-версена заливают монослой культуры клеток так, чтобы все участки были покрыты жидкостью. В матрацы объемом 100,0; 250,0 и 1000,0 мл раствор добавляют соответственно по 10,0; 15,0 и 30,0 мл. Матрасы встряхивают и помещают в термостат (37^оС) на 15-20 мин до полного отделения клеток от поверхности стекла. Крупные конгломераты клеток диспергируют, пипетируя несколько раз клеточную взвесь. Суспензию клеток центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин, смесь трипсин-версен удаляют. Осажденные центрифугированием клетки ресуспендируют в небольшом объеме ростовой питательной среды, количество клеток подсчитывают в счетной камере Горяева. Взвесь клеток контролируют на бактериальную стерильность, разводя питательной средой с таким расчетом, чтобы в 1,0 мл содержалось 60 тыс. клеток. В качестве среды для выращивания клеток используют среду Игла, среду 199, Игла-МЕМ с добавлением телячьей сыворотки крупного рогатого скота (10%) и антибиотиков. Перевиваемую культуру НЕр-2 разливают в пробирки по 1,0 мл. В качестве поддерживающей среды используют те же вышеприведенные питательные среды без добавления сыворотки. Обновление сплошного монослоя клеток новой генерации наблюдают через 5-6 сут.

Титрование вирусов. Количественное определение того или иного иммунологического типа энтеровирусов (стандартные штаммы) проводят в культуре клеток НЕр-2 методом конечного разведения по цитопатогенному действию и выражают в lg (ЦПД₅₀/мл). Для титрования вируса полиомиелита типа 1 (штамм Луговской) вначале готовят его разведения, обычно десятикратные, от 10^-1 до 10^-8. Во все пробирки вносят по 9,0 мл стерильного физиологического раствора или раствора Хенкса. Затем в первую пробирку вносят 1,0 мл вируссодержащего материала и получают разведение 10^-1 (1:10). При помощи новой пипетки содержимое первой пробирки тщательно перемешивают и 1,0 мл переносят во вторую пробирку, получая разведение 10^-2 (1:100), и т.д. до 10^-8.

Предварительно перед заражением монослоя культуры НЕр-2 вирусом производят трехкратное отмывание культуры клеток от сыворотки раствором Хенкса, рН 7,4, или раствором Эрла, рН 7,6. На каждое десятикратное разведение вируссодержащего материала используют по 4 пробирки с культурой клеток. Вируссодержащий материал в объеме 0,2 мл вносят в пробирки с культурой клеток, в которые предварительно заливают поддерживающую среду в объеме 0,8 мл. Пробирки помещают в термостат в специальных лотках в горизонтальном положении. Состояние зараженных культур периодически проверяют под световым микроскопом в течение 7 дней. Результат цитопатического действия ЦПД₅₀ вируса считается положительным, если не менее половины клеток в культуре подверглись специфической дегенерации. Титр (50,0% эффективной зоны) вычисляют методом конечного разведения (лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний, 1974, М.: Медицина, с.5-56, под ред. проф. Леннета Э. и Шмидта Н.; Ворошилова М.К. Жевандрова В.И., Белоян М.С. Методы лабораторной диагностики энтеровирусных инфекций, М, Медицина, 150 C) и методом пробитов, используя специальные таблицы (Методические рекомендации по санитарно-вирусологическому контролю объектов окружающей среды, 1982, М, 76 C., под ред. проф. Дроздова С.Г. и Казанцевой В.А.).

Внесение вируса и томатозида в воду. В 100,0 мл воды, свободной от вирусов, вносят вирус полиомиелита, тип 1 (штамм Луговской) в дозах 1х10⁵; 1х10⁶; 1х10⁷ ЦПД₅₀. На каждую дозу вируса используют по 6 емкостей с питьевой водой. В емкости под NN 1-5 вносят томатозид с таким расчетом, чтобы конечная концентрация составила 0,1; 0,05; 0,025; 0,0125 и 0,00625% соответственно. В шестую емкость стероидный гликозид не вносят, т.е. последний флакон, куда был внесен только вирус, используют в качестве контроля.

Определение вирулицидной активности томатозида по остаточному количеству вируса в воде. Спустя час после внесения стероидного гликозида (томатозида) в воду, где предварительно был внесен вирус полиомиелита, методом конечного разведения по цитопатическому эффекту определяют остаточное количество вируса. Для этого пробы воды, куда были внесены различные дозы томатозида, а также образцы проб воды, где был внесен только вирус, в объеме 2,0 мл стерилизуют путем пропускания через пластины "Millipore" с диаметром пор 0,22 мкм. Количество вируса в воде, обработанной и не обработанной томатозидом, определяют методом конечного разведения по ЦПД₅₀ по ранее описанной выше общеизвестной методике.

Для титрования остаточного вируса (включая контроль) обычно готовят десятикратные разведения вируссодержащего материала в воде от 10^-1 до 10^-8. На каждое десятикратное разведения вируссодержащего материала используют по 4 пробирки с культурой клеток. Исследуемый образец пробы воды (после титрования) вносят на монослой культуры клеток в объеме 1,0 мл, затем инкубируют клетки при 37^оС в течение 1 ч, после чего жидкость удаляют, вносят среду, поддерживающую рост клеток, без сыворотки. После той процедуры инкубирование культур производят при 37^оС. Состояние зараженных культур периодически проверяют под световым микроскопом в течение 7 дней.

Опыт сопровождается следующими контролями:
1. Контроль интактной культуры клеток НЕр-2 без добавления в поддерживающую среду томатозида.

2. Контроль интактной культуры клеток НЕр-2 при наличии томатозида в поддерживающей среде в концентрациях 0,1; 0,05; 0,025; 0,0125 и 0,00625%.

3. Контроль за состоянием монослоя культуры клеток НЕр-2, инфицированной питьевой водой, куда не был внесен ни вирус, ни стероидный гликозид - томатозид.

4. Контроль за остаточным количеством вируса в питьевой воде, куда бы внесен только штамм вируса полиомиелита типа 1 (Луговской), после экспозиции воды при комнатной температуре (19-22^оС) в течение 1 ч.

Степень специфической дегенерации монослоя культуры клеток НЕр-2 оценивают по четырехбальной системе: 4+ - деструкция всех клеток в пробирке; 3+ - большей части клеток; 2+ - половины клеток; 1+ - меньше половины клеток. Отсутствие цитопатогенного действия вируса полиомиелита обозначают знаком минус. Результат цитопатогенного действия вируса считается положительным, если не менее половины клеток в культуре подвергается специфической дегенерации.

Учет цитопатогенного действия вируса проводят как указано выше при соблюдении вышеперечисленных контролей: отсутствие каких-либо цитоморфологических, дегенеративных изменений в монослое интактной культуры клеток НЕр-2 при наличии и отсутствии томатозида в поддерживающей среде, наличии инфекционного вируса в образцах проб воды, куда вносят только вирус, и отсутствие цитопатогенного действия вируса в культуре клеток, инфицированной образцами исходной питьевой воды, т.е. до экспозиции, куда не вносят ни вирус, ни томатозид.

Достоверность результатов определения вирулицидной активности томатозида на модели вируса полиомиелита оценивают по значимости индекса нейтрализации активности инфекционности вируса (Карышева А.Ф., Сюрин В.Н. Руководство по практической вирусологии, Кишинев, Штиинца, 1980, 210 с.).

Анализ результатов. Определение количества вируса полиомиелита, внесенного в дозах 1х10⁵; 1x10⁶; 1х10⁷ ЦПД₅₀ в питьевую воду, не обработанную томатозидом, после одного часа экспозиции при комнатной температуре (19-22^оС) показало, что оно составляет 2,14; 3,40 и 4,29 lg ЦПД₅₀/мл, соответственно. Вместе с тем не удалось определить количество вируса, внесенного в дозах 1х10⁵ и 1х10⁶ ЦПД₅₀ в питьевую воду, обработанную томатозидом в концентрации 0,1 и 0,05% при том же режиме экспозиции. При увеличении дозы внесенного вируса в питьевой воде до 1х10⁷ ЦПД₅₀ на 100 мл воды, содержащей томатозид в вышеуказанных концентрациях, удалось установить, что незначительная часть вируса инактивируется (табл.2). Изучение вирулицидной активности томатозида в воде в концентрации 0,025; 0,0125 и 0,00625% показало, что она практически отсутствует. Об этом также свидетельствуют различные значения индекса нейтрализации инфекционной активности вируса полиомиелита в воде при вариации концентрации стероидного гликозида (томатозида) в воде (табл.3).

Таким образом, проведенные исследования показали, что томатозид инактивирует большие дозы инфекционного вируса человека до 2,5 х 10⁴ ЦПД₅₀ на 100,0 мл воды.

Использование: медицинская вирусология. Сущность изобретения: известный стероидный гликозид-томатозид используют в качестве ингибитора энтеровирусов человека и животных. 3 табл.

ИНГИБИТОР ЭНТЕРОВИРУСОВ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ.

Применение томатозида в качестве ингибитора энтеровирусов человека и животных.