СРЕДСТВО ДЛЯ ИНАКТИВАЦИИ РОТАВИРУСОВ Российский патент 1996 года по МПК C12N7/06 A61K39/187 C12N7/06 C12R1/92 

Изобретение относится к медицинской вирусологии, а именно к средству для инактивации вирусов человека и животных.

Задача изобретения расширение ассортимента ингибиторов ротавирусов. Для осуществление этого в качестве ингибитора ротавирусов используют раствор томатозида триозид-(25S)-5 α -3 β,22 α26-триол-26-0- β -D-глюкопиранозид в концентрации 0,005 и выше, которая среды испытанных оказалась оптимальной.

Томатозид представляет собой порошкообразное кристаллическое вещество желто-коричневого цвета, устойчивое к действию света, гигроскопическое, срок хранения в герметической упаковке при комнатной температуре 5 лет, растворимое в воде. Препарат, являясь вторичным метаболитом высших растений, не обладает цито- и фитотоксичностью. Препарат триозид-(25S)-5 α -3 β,22 α26-триол-26-0- β-D-глюкопиранозид получают путем экстракции семян томатов 70,0% -ным метанолом. Экстракт упаривают досуха и многократно хроматографируют на колонке с силикагелем [1]
Известно использование томатозида в качестве стимулятора роста растений, в частности свеклы [2]
Инактивацию вируссодержащего материала проводят путем добавления томатозида в конечной концентрации 0,005% и выше. Затем смесь выдерживают при комнатной температуре (18-22^оС). в течение 1 ч и более. Проявление антивирусного действия препарата выявляют при определении инфекционного вируса в культуре клеток.

Противовирусное действие препарата демонстрирует следующий пример.

В отдельные емкости с питьевой водой (предварительно проконтролированной на отсутствие в ней вирусов) вносят обезьяний вирус SA-11, адаптированный к росту в перевиваемой культуре СПЭВ, в разных дозах и добавляют 100,0; 50,0; 25,0; 12,0 и 6,0 мг томатозида. Смеси экспонируют в течение 1 ч при комнатной температуре (22^оС). Проявление вирулицидного действия препарата контролируют по исчезновению инфекционности вируса в культуре клеток СПЭВ, пермиссивных для их репродукции.

Ингибитор.

Используют стероидный глюкозид томатозид, представляющий собой порошкообразное, кристаллическое веществ белого с желтым оттенком цвета, растворимое в воде, не обладающее цито- и фитотоксичностью.

Приготовление перевиваемой культуры СПЭВ.

Перед посевом культуры проводят просмотр и оценку монослоя. Отбирают культуру со сплошным монослоем клеток, имеющим типичную для данной линии морфологию, с четко выраженными границами между клеток. Клетки снимают со стекла матрасов трипсин-версеном. Для этого готовят смесь равных объемов 0,25% -ных растворов трипсина и версена, подогревают ее в водяной бане до 35^оС. Вначале с матрасов выливают питательную среду, клеточный монослой промывают 3 раза фосфатно-буферным раствором (рН 7,5), не содержащим ионы кальция и магния. Затем теплой смесью трипсин-версена заливают монослой культуры клеток так, чтобы все участки были покрыты жидкостью. В матрасы объемом 100,0; 250,0 и 1000,0 мл раствор добавляют соответственно по 10,0; 15,0 и 30,0 мл. Матрасы встряхивают и помещают в термостат (37^оС) на 15-20 мин до полного отделения клеток от поверхности стекла. Крупные конгломераты клеток диспергируют, пипетируя несколько раз клеточную взвесь. Суспензию клеток центрифугируют 10 мин при 2000 об./мин, смесь трипсин-версен удаляют. Осажденные центрифугированием клетки культуры СПЭВ ресуспендируют в небольшом объеме ростовой питательной среды, количество клеток подсчитывают в счетной камере Горяева. Взвесь клеток контролируют на бактериальную стерильность, разводят питательной средой с таким расчетом, чтобы в 1,0 мл содержалось 90 тыс. клеток. В качестве среды для выращивания клеток культуры СПЭВ используют среду Игла МЕМ или среду Игла с 10% сыворотки крупного рогатого скота и с антибиотиками из расчета 25 тыс.ед. пенициллина и 25,0 мг стрептомицина на 100,0 мл среды. Перевиваемую культуру СПЭВ разливают в пробирки по 1,0 мл. В качестве поддерживающей среды используют те же питательные среды без добавления сыворотки. Обновление сплошного монослоя клеток новой генерации наблюдают через 4-5 суток.

Титрование вируса.

Количественное определение ротавируса SA-11 проводят в культуре клеток СПЭВ методом конечного разведения по цитопатогенному действию и выражают в lg ЦПД₅₀/мл. Для титрования ротавируса SA-11 вначале готовят его разведения (обычно десятикратные) от 10^-1 до 10^-8. Во все пробирки вносят по 9,0 мл стерильного физиологического раствора или раствора Хенкса. Затем в первую пробирку вносят 1,0 мл вируссодержащего материала и получают разведение 10^-1 (1: 10). При помощи новой пипетки содержимое первой пробирки тщательно перемешивают и 1,0 мл переносят во вторую пробирку, получая разведение 10^-2 (1: 100) и т.д. до 10^-8.

Предварительно перед заражением монослоя культуры СПЭВ вирусом SA-11 производят трехкратное промывание культуры клеток от сыворотки раствором Хенкса (рН-7,4) или раствором Эрла (рН-7,6). На каждое десятикратное разведение вируссодержащего материала используют по 4 пробирки с культурой клеток. Вируссодержащий материал в объеме 0,2 мл вносят в пробирки с культурой клеток, адсорбцию проводят 1 ч при температуре 37^оС, затем добавляют поддерживающую среду в объеме 0,8 мл, содержащую трипсин в конечной концентрации 20,0 мкг/мл и инкубируют при 37^оС. Пробирки помещают в термостат в специальных лотках в горизонтальном положении. Состояние зараженной культуры периодически проверяют под световым микроскопом в течение 7 дней. Результат цитопатического действия ЦПД₅₀ вируса считают положительным, если не менее половины клеток в культуре подверглись специфической дегенерации. Титр (50,0% эффективной дозы) вычисляют методом конечного разведения (Лабораторная диагностика вирусных и рикетсиозных заболеваний. /Под ред. проф. Леннета Э. и Шмидта Н. М. Медицина, 1974, с.5-56. Ворошилова М.К. Жевандрова В. И. и Балоян М.С. Методы лабораторной диагностики энтеровирусных инфекций. М. Медицина, 1964, 150 с.) и методом пробитов, используя специальные таблицы (Методические рекомендации по санитарно-вирусологическому контролю объектов окружающей среды./Под ред. проф. Дроздова С.Г. и Казанцевой В.А. М. 1982, 76 с.).

Внесение ротавируса и томатозида в воду.

В 100,0 мл воды, свободной от вирусов, вносят ротавирус SA-11 в дозах (в объеме 10,0 мл вируссодержащей суспензии) 1х10⁵; 1х10⁶; 1х10⁷ ЦПД₅₀. На каждую дозу вируса используют по 7 емкостей с питьевой водой. В емкости 1-5 вносят томатозид в количестве 100,0; 50,0; 25,0; 12,0 и 6,0 мг соответственно. Шестую и седьмую емкости используют в качестве контроля в шестую емкость вносят только вирус, а в последнюю (седьмую) никаких ингредиентов не добавляют. Все емкости выдерживают 1 ч при комнатной температуре (22^оС).

Определение вирулицидной активности томатозида по остаточному количеству вируса в воде.

Спустя 1 ч после внесения стероидного гликозида в воду, куда предварительно был внесен ротавирус SA-11, методом конечного разведения по цитопатическому эффекту определяют остаточное количество вируса. Для этого пробы воды, куда были внесены различные дозы триозида-(25 S)-5 α -3 β,22 α26-триол-26-0- β -D-глюкопиранозид, а также образцы пробы воды, куда был внесен только вирус SA-11 в объеме 2,0 мл, фильтруют через пластины Milipore с диаметром пор 0,22 мкм, с целью исключения бактериальной контаминации. Количество вируса в воде, обработанной и не обработанной томатозидом, определяют методом конечного разведения по ЦПД₅₀ по выше описанной методике. Для определения остаточного вируса (включая контроль) готовят десятикратные разведения от 10^-1 до 10^-8. На каждое десятикратное разведение вируссодержащего материала используют по 4 пробирки с культурой клеток. Затем вируссодержащий материал вносят на монослой перевиваемой культуры СПЭВ в объеме 0,2 мл, инкубируют при 37^оС в течение часа, после чего жидкость удаляют и вносят поддерживающую среду в объеме 0,8 мл, содержащую трипсин в концентрации 20,0 мкг/мл. После этой процедуры инкубирование культур производят при 37^оС. Состояние инфицированных культур периодически проверяют под световым микроскопом в течение 7 дней.

Опыт сопровождается следующими контролями:
1. Контроль интактной культуры клеток СПЭВ без добавления в поддерживающую среду томатозида. Поддерживающая среда содержит только 20,0 мкг/мл трипсина и антибиотики.

2. Контроль интактной культуры клеток СПЭВ при наличии трипсина и томатозида в поддерживающей среде. Последний в концентрации 0,02; 0,01; 0,005 и 0,0024%
3. Контроль за состоянием монослоя культуры клеток СПЭВ, на который была внесена проба воды, не содержащей ни вирус, ни томатозид. Поддерживающая среда содержит трипсин и антибиотики в выше указанных концентрациях.

4. Контроль за остаточным количеством вируса в питьевой воде, куда был внесен только вирус SA-11. Поддерживающая среда содержит трипсин (20,0 мкг/мл) и антибиотики.

Степень дегенерации монослоя культуры СПЭВ оценивают по 4-бальной системе: 4⁺ диструкция всех клеток в пробирке; 3⁺ большей части клеток; 2⁺ половины клеток; 1⁺ меньше половины клеток. Отсутствие цитопатогенного действия вируса SA-11 обозначают знаком "-". Результаты цитопатогенного действия вируса SA-11 считают положительным, если не менее половины клеток в культуре СПЭВ подвергается специфической дегенерации. Специфичность дегенерации монослоя клеток СПЭВ также проверяют в реакции РНГА и ИФВ. Для первого теста используют диагностикум эритроцитарный ротавирусный иммуноглобулиновый научно-производственного объединения "Ростэпидкомплекс", для второго тест-систему для детекции ротавирусного антигена, разработанную в НИИ микробиологии и эпидемиологии им.Пастера.

Учет цитопатогенного действия вируса проводят как указано выше при соблюдении вышеперечисленных контролей: отсутствие каких-либо цитоморфологически, дегенеративных изменений в монослое интактной культуры клеток СПЭВ при наличии и отсутствии томатозида в поддерживающей среде, наличии инфекционного вируса в образцах проб воды, куда вносят только вирус, и отсутствие цитопатогенного действия вируса в монослое культуры клеток, куда не вносили ни вирус, ни стероидный гликозид. Достоверность результатов определения вирулицидной активности томатозида на модели ротавируса SA-11 оценивают по значимости индекса нейтрализации активности инфекционности вируса.

Анализ результатов.

Определение количества ротавируса SA-11 внесенного в дозах 1 х 10⁵; 1х10⁶; 1х10⁷ ЦПД₅₀ в питьевую воду, не обработанную томатозидом, после одного часа экспозиции при комнатной температуре (22^оС) показало, что оно составляет 2,7; 3,7 и 4,7 lg ЦПД₅₀/мл соответственно (табл.1 и 2). Вместе с тем не удалось определить количество вируса, внесенного в дозах 1х10⁵ и 1х10⁶ ЦПД₅₀ в питьевую воду, обработанную томатозидом в конечной концентрации 0,01 и 0,02% при том же режиме экспозиции. При увеличении дозы внесенного вируса в питьевой воде до 1х10⁷ ЦПД₅₀ на 100,0 мл воды, содержащей томатозид в вышеуказанных концентрациях, удалось установить, что незначительная часть вируса инактивируется (табл.3). Изучение антивирусной активности томатозида в концентрации 0,005 и 0,0024% показало, что в первом случае оно еще сохраняется (индекс нейтрализации инфекционной активности вируса SA-11 составил 10-50) во втором она практически отсутствует. Об этом также свидетельствует значение индекса нейтрализации (0 и < 10) при конечной концентрации томатозида в питательной среде 0,0024%
Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о значительной антивирусной активности стероидного гликозида по отношению к ротавируса, в частности против вируса SA-11.

Использование: изобретение относится к медицинской вирусологии, а именно к средству для инактивации ротавирусов человека и животных. Сущность: предлагается использовать триазид-(25 S)-5 α=3β,22α, 26-триол-26-0- β -D-глюкопиранозид(томатоэндо) в конечной концентрации 0,005% и выше для инактивации ротавирусов. Инактивацию ротавирусов проводят добавлением к вируссодержащему материалу раствора томатозида в указанной концентрации. Затем смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч и более, а проявление антивирусного действия средства выявляют при определении инфекционности вируса в культуре клеток. 3 табл.

Применение триозид -(25S)-5α-3β, 22α, 26- триол-26-0- β -D-глюкопиранозида в качестве средства для инактивации ротавирусов.