СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЧИЩЕННОЙ БИОМАССЫ ВИРУСА ГРИППА Российский патент 1996 года по МПК C12N7/00 C12N7/02 

Изобретение относится к микробиологической технологии, а именно к очистке вирусов, и может найти применение при изготовлении вакцин и вирусных антигенов, что очень важно в период массовых эпидемий, когда необходимо обрабатывать большие количества вирусного материала.

Известны способы очистки вирусов на различных сорбентах.

Известен способ очистки полиовируса, а также бактериофага f2 активированным углем. В данном случае вируссодержащую жидкость пропускают через колонку, заполненную углем. Однако наряду с сорбцией вируса здесь наблюдалась и сорбция белков. Кроме того, для получения очищенной биомассы вируса в данном примере необходима дополнительная стадия десорбции вируса.

Описан способ сорбции белков (альбумина, γ -глобулина) из биологически активных жидкостей, не содержащих вирусов, с помощью углеволокнистого адсорбента. Характеристики этого угольного волокна в зависимости от степени активации приведены в табл.1.

Недостатком способа является малая сорбция за достаточно большой промежуток времени (0,2-2,0 мг/мл за 60 мин). К тому же, активности данного сорбента недостаточно для того, чтобы очистить вирус от белков, так как обычно вируссодержащая жидкость содержит 3-17 мг/мл, белков.

Известны также волокна (полиакрилонитрильное волокно марки КФМ и поливинилспиртовое волокно марки КПАК-А), cпособные поглощать инсулин и адреналин в больших количествах.

Однако данные сорбенты не пригодны для сорбции белков аллантоисной жидкости (см.табл.2).

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ предварительной очистки вируссодержащей жидкости от балластных белков путем использования в качестве сорбента никельсодержащего поливинилспиртового волокна. Сорбция белков происходит при погружении в аллантоисную жидкость 4-6 порций волокон а при времени контакта каждой порции с жидкостью 2-5 мин. При этом ПВС-волокно содержит 2-3 мас. никеля, а соотношение объем вируссодержащей жидкости: cорбент равно 50-60:1.

Недостаток этого способа заключается в том, что за суммарное время контакта 4-6 порций волокна, равное 8-30 мин, очищается небольшое количество аллантоисной жидкости. При этом расход сорбента для извлечения белка (4-6 порций волокна на один объем вируссодержащей жидкости) достаточно велик. Кроме того, получение никельсодержащего ПВС-волокна требует достаточно трудоемких операций.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение технологичности и производительности процесса с одновременным сохранением высокой степени очистки по белку.

Технический результат достигается за счет сорбции балластных белков аллантоисной жидкости путем погружения в жидкость одной порции угольного волокна с сорбционной емкостью по метиленовому голубому 900-1000 мг/г при соотношении объем жидкости сорбент 90-100:1 и времени контакта 10-15 мин.

Существенным отличием предлагаемого способа получения очищенной вируссодержащей биомассы является проведение сорбции белков на угольном волокнистом сорбенте с сорбционной емкостью 900-1000 мг/л по метиленовому голубому в течение 10-15 мин при соотношении объем жидкости сорбент 90-100:1. Причем процесс сорбции белков осуществляется за счет погружения в вируссодержащую жидкость только одной порции угольного волокна. В отличие от прототипа угольное волокно, используемое в данном способе, выпускается в промышленных условиях (Светлогорское ПО "Химволокно") по ТУ 6-16-3091-89.

Известны способы с использованием сорбентов на основе активированного угля, а также волокнистых металлсодержащих сорбентов, в частности, медьсодержащих на основе ПВС-волокна. Однако все указанные сорбенты использовались для сорбции вирусов и, в частности, вирусов гриппа, хотя в незначительной степени они могут сорбировать и белки вируссодержащей жидкости. Использование сорбента по методике заявляемого способа не привело к положительному результату (см. пример 18 табл.3).

Известны способы с использованием сорбентов на основе ПВС-волокна, а также угольных волокнистых сорбентов в частности, угольного волокна, в отношении которого был поставлен эксперимент. Экспериментальным путем было показано, что данное волокно, подобно другим известным волокнистым сорбентам, не способно сорбировать белки вируссодержащей жидкости (пример 21 табл.3).

П р и м е р. Угольное волокно с сорбционной емкостью по метиленовому голубому 1000 мг/г погружают, в вируссодержащую жидкость при соотношении объем вируссодержащей жидкости сорбент, равном 100:1, выдерживают в вируссодержащем жидкости в течение 12 мин. Волокно вынимают из жидкости. Определяют содержание белка и вируса в нативной вируссодержащей жидкости (до погружения волокна в вируссодержащую жидкость) и в очищенной вируссодержащей жидкости (после контакта с волокном). Степень очистки по белку определяют по следующей формуле:
K где С₁ концентрация белка в исходной (нативной) вируссодержащей жидкости, мг/мл;
С₂ концентрация белка в очищенной вируссодержащей жидкости (после контакта с волокном), мг/мл.

Определение белка проводили по двум методикам: по методу Лоури с помощью реактива Фолина и путем измерения гемагглютинационной активности (ГА). Определение биологической активности вируса гриппа проводили по методике ИА.

Примеры, характеризующие способ получения очищенной биомассы вирусов при различных параметрах процесса, приведены в табл.3.

Экспериментально показано, что высокая сорбция балластных белков вируссодержащей жидкости угольным волокнистым сорбентом достигается при сорбционной емкости волокна по метиленовому голубому в интервале 900-1000 мг/г (примеры 2, 3). Снижение ее (пример 1) ведет к ухудшению выбираемости белков из вируссодержащей жидкости, увеличение же (пример 4) не дает увеличения степени очистки.

Уменьшение соотношения объем вируссодержащей жидкости сорбент приводит к непроизводительному использованию волокна и, кроме того, в небольшой объем жидкости невозможно загрузить достаточно большое количество волокна (пример 18). Увеличение же данного соотношения приводит к снижению выбираемости белка (пример 14).

Из данных табл. 3 следует, что оптимальным временем контакта угольного волокнистого сорбента с вируссодержащей жидкостью является 10-15 мин (примеры 7-9). Сокращение времени контакта (пример 6) приводит к ухудшению характеристик получаемой очищенной биомассы вируса. Увеличение времени контакта более 15 мин (пример 10) не приводит к дальнейшему изменению степени очистки по белку.

Кроме того, из данных табл.3 следует, что оптимальным количеством порций сорбента является 1 (пример 13). Уменьшение количества порций волокна по понятным причинам невозможно, а увеличение количества порций при сохранении времени контакта нецелесообразно, так как делает процесс экономически невыгодным из-за дополнительных расходов волокна, кроме того, не приводит к изменению степени очистки по белку (примеры 15, 16).

Из табл. 3 видно, что при использовании угольного волокнистого сорбента по предлагаемому способу за 1 мин очищается в зависимости от режима сорбции 6,6-10 мл аллантоисной жидкости (примеры 2-4, 8-10, 12, 13). Данные приведены в пересчете на 1 г сорбента. Следует отметить, что в запредельных точках (примеры 1, 7, 10, 11, 14-16) производительность процесса (количество очищаемой жидкости) не превышает указанную. Исключение составляет пример 6, в котором при уменьшении времени контакта до 8 мин производительность процесса возрастает до 12 мл/мин. Однако при этом степень очистки по белку снижается до 7,8 раз. Таким образом, данный пример не является показательным.

При использовании же в качестве сорбента никельсодержащего ПВС-волокна, взятого в качестве прототипа, за 1 мин очищается лишь 0,75 мл вируссодержащей жидкости. Это наглядно показывает, что применение угольного волокнистого сорбента приводит к увеличению производительности процесса по сравнению с прототипом.

Использование других волокнистых сорбентов не обеспечивает достижения цели (примеры 18-21).

Таким образом, указанный технический результат достигается только по предлагаемому способу, характеризующемуся совокупностью перечисленных признаков.

Преимуществом заявляемого способа получения очищенной биомассы вирусов в сравнении с прототипом является повышение технологичности и производительности процесса при сохранении высокой степени очистки по белку за счет:
1) сокращения количества волокна, требуемого для очистки вируссодержащей жидкости;
2) увеличения соотношения объем вируссодержащей жидкости сорбент;
3) использования угольного волокнистого сорбента, выпускаемого в промышленности, и, таким образом, исключения трудоемких операций получения сорбента в лабораторных условиях.

Изобретение относится к микробиологической технологии, а именно к очистке вирусов. Изобретение может найти применение при изготовлении вакцин и вирусных антигенов, что очень актуально в период массовых эпидемий, когда требуется обрабатывать достаточно большие количества вирусного материала. Сущность предлагаемого изобретения состоит в том, что очищенную биомассу вируса гриппа получают за счет сорбции из вируссодержащей аллантоисной жидкости балластных белков. Сорбцию осуществляют погружением в вируссодержащую жидкость порции угольного волокнистого сорбента с сорбционной емкостью по метиленовому голубому 900 - 1000 мг/г. При этом соотношение объем вируссодержащей жидкости: сорбент равно 90 - 100 : 1 и время контакта сорбента с жидкостью 10 - 15 мин. Техническим результатом данного изобретения является повышение технологичности и производительности процесса с одновременным сохранением высокой степени очистки по белку. 3 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЧИЩЕННОЙ БИОМАССЫ ВИРУСА ГРИППА, включающий погружение сорбента в вируссодержащую жидкость с последующей сорбцией из нее белка, отличающийся тем, что из сорбентов используют угольный волокнистый сорбент с сорбционной емкостью по метиленовому голубому 900 1000 нг/г при соотношении объема сорбента и объема жидкости 1 (90 100), а сорбцию проводят в течение 10 15 мин.