СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА (ИФА) Российский патент 2006 года по МПК G01N33/551 C12Q1/04 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для выявления возбудителей особо опасных инфекций с низкой концентрацией с помощью модифицированного иммуноферментного анализа (ИФА).

Чувствительность и специфичность ИФА обусловлена не только степенью чистоты и активности используемых ингредиентов, но и свойствами твердой фазы, которая должна сохранять иммунологические свойства и стабильность в иммобилизованном состоянии, обладать минимальной активностью неспецифически связывать компоненты анализируемой системы и быть удобной при разделении фаз [1]. В качестве твердой фазы используется поливинил, дакрил и другие синтетические полимеры, из которых изготавливают пробирки [2], микропланшеты из оптически прозрачного полистирола [3]. Известно применение магнитных частиц [4], магнитных бус [5].

Известен способ диагностики с помощью иммуноферментного анализа при использовании полистироловых планшет. Однако, наряду с достоинствами, данная твердая фаза имеет ряд проблем. Микропланшеты обладают не одинаковыми сорбционными свойствами, что существенно влияет на достоверность и воспроизводимость полученных результатов [6]. Количество антител (антигенов), используемое для образования иммунного комплекса, ограничено возможностями твердой фазы [7]. Недостаточная концентрация антител (антигенов) ограничивает чувствительность ИФА. Повышение концентрации иммуноглобулинов на твердой фазе приводит к адсорбции свободно связанных антител, которые элюируют на последующих этапах инкубирования, отмывки и тем самым снижают чувствительность и специфичность метода. Процесс сорбции обратим и, следовательно, сенсибилизированные планшеты, полученные сорбционным путем, не подлежат длительному хранению (срок хранения 20 дней на холоде при герметизации) [8, 9].

Известен способ диагностики с помощью иммуносорбента, полученного путем активации аминопропилсилохрома глутаровым альдегидом в концентрации 12-13% в течение 2 ч при комнатной температуре и рН 8,0 с последующим ковалентным связыванием белка А и промывкой (а.с. СССР №1517545, G 01 N 33/53, 15.12.93, Бюл.№45).

Используемый в качестве активирующего агента глутаровый альдегид гидролизуется в водной среде, что приводит к неспецифической сорбции и снижению стабильности в биоспецифических процессах.

Наиболее близким к заявляемому является способ диагностики с помощью иммуносорбента, полученного эмульсионной полимеризацией смеси сомономеров полиакриламида и катализатора с обработанным магнитным порошком. Подготовленный магносорбент активируют 5% глутаровым альдегидом в течение 18-20 ч и иммобилизуют специфическими иммуноглобулинами в растворе ФСБ при инкубации в течение 18-20 ч [10].

Недостатками способа диагностики является применение в качестве твердой фазы магноиммуносорбента, при получении которого использованы дорогостоящие импортные высокотоксичные реактивы, ухудшающие экологические условия процесса.

Целью изобретения является усовершенствование постановки ИФА за счет применения разработанной твердой фазы с иммобилизованными иммуноглобулинами.

Технический результат изобретения, заключающийся в упрощении, сокращении времени постановки ИФА, повышении срока годности иммобилизованной твердой фазы при высокой чувствительности и специфичности, достигается тем, что в качестве твердой фазы используются иммуноглобулиновые магноиммуносорбенты (полученые путем связывания 7,5% оксида железа (Fe₂О₃) в 0,1 М фосфатно-солевом буферном растворе рН 7,2 с 10 мг иммуноглобулинов, 2 часовой инкубации, отмывании от несвязавшихся компонентов), взаимодействующие с антигеном (Аг) 30-60 мин при температуре (22±4)°С, отмытые с помощью постоянного магнита от несвязавшегося Аг 10-кратным объемом 0,1 М фосфатно-солевого буферного раствора с 0,5% твин-20, взаимодействующие с рабочим разведением иммуноглобулинового пероксидазного конъюгата 15 мин при температуре (22±4)°С, отмытые от несвязавшегося конъюгата 60-кратным объемом по вышеописанному способу и учета реакции после ферментспецифического субстрата.

В качестве твердой фазы выбран оксид железа (Fe₂О₃) в связи с тем, что ионы металлов в металлопротеинах несут двойную функцию: первая из них - ориентировочный или матричный эффект, а вторая - эффект концентрирования на участке протекания реакции. Сам пептид имеет слабожесткую структуру и не обладает каталитическими свойствами. Если ион металла связан с пептидом, то последний приобретает активность, благодаря эффекту оттягивания электронной плотности положительно заряженными электронами металла [11]. Таким образом, введение магнитного материала значительно повышает специфическую активность и упрощает, ускоряет анализ.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие преимущества: постановка ИФА проходит на твердой фазе, при получении которой используются доступные реактивы, способ обеспечивает экологически безопасную технологию получения магноиммуносорбентов с сокращением трудовых (отпала необходимость в инкубации носителя с активаторами) и материальных затрат (нет необходимости в импортных реактивах) при увеличении срока годности иммобилизованной твердой фазы до 3 лет (срок наблюдения).

Постановка ИФА заключалась в следующем: внесение во флаконы с 0,2 мл 10% суспензии иммуноглобулиновых магноиммуносорбентов по 1 мл взвеси соответствующей концентрации антигена, инкубация в течение 30-60 мин при температуре (22±4)°С, отмывка с помощью постоянного магнита от несвязавшихся антигенов 10-кратным объемом 0,1 М фосфатно-солевого буферного раствора с 0,5% твин-20, внесение по 200 мкл рабочего разведения иммуноглобулинового пероксидазного конъюгата, инкубация при температуре (22±4)°С в течение 15 мин, отмывка 60-кратным объемом по вышеописанному способу и внесение во флаконы по 200 мкл хромогенной смеси, остановка реакции через 1-2 мин, внесение по 50 мкл стоп-реагента (2 М раствором серной кислоты) и учет реакции фотометрически при длине волны 492 нм или визуально. Ответ считали положительным при превышении оптической плотности опытного раствора над контрольным (без контакта с антигеном) в 2 и более раза.

Определена специфическая активность иммуноферментного анализа (ИФА). В результате установлено, что чувствительность анализа в 1000 раз выше (50-100 м.к./мл), чем в традиционном ИФА (с полистироловыми планшетами).

Магнитные свойства твердой фазы ИФА (магносорбентов) исследованы по методике и с использованием технических средств, предложенных В.И.Ефременко с соавт.[12]. В динамике на протяжении 24 часов была изучена стабильность удерживания магноиммуносорбента в магнитной ловушке при пропускании через нее проточной воды (при скорости пропускания 3 л в 1 мин). Обнаружен 100% эффект удерживания МИС в модельной системе, при отсутствии десорбции антител.

Вторым способом определения стабильности твердой фазы (отсутствие десорбции антител) являлся следующий: в емкость с 1 л водопроводной воды помещали 0,5 мл МИС туляремийных на трое суток, помешивая 3-4 раза в день. На четвертые сутки при постановке ИФА с МИС туляремийными чувствительность анализа не снизилась и составила 1×10² м.к./мл.

Устойчивость комплекса антител с магнитным материалом, вероятно, обусловлена образованием прочной химической связи между ними (электрический фактор стабилизации), возникающей благодаря взаимодействию электрических полей создаваемых электронами и ядрами атомов, участвующих в образовании веществ (магнитный материал имеет заряд и антитела, т.к. их рН, в данном случае, выше изоэлектрической точки).

Нами разработан способ диагностики особо опасных инфекций, при постановке которого в качестве твердой фазы выступают магносорбенты с иммобилизованными антителами, и сконструированы диагностические тест-системы для проведения сочетанного метода детекции микроорганизмов в иммуноферментном анализе, подобраны условия постановки ИФА с МИС. ИФА с применением МИС обладает селективным концентрированием, высокой чувствительностью (1×10²-5×10¹ м.к. в пробе), быстротой постановки реакции (50-60 мин), что подтверждено многочисленными испытаниями. При этом отпадает необходимость использования сенсибилизированных микропланшет.

Высокую чувствительность ИФА с применением магноиммуносорбентов можно объяснить еще и тем, что для таких ферментов как пероксидаза (мы ее используем при изготовлении иммуноферментного конъюгата), металлы повышают каталитическую функцию [13].

Возможность практического применения изобретения иллюстрируется примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.

Пример 1. Постановка иммуноферментного анализа (ИФА) на твердом носителе - магноиммуносорбенте.

Из культур туляремийного микроба готовили взвеси с концентрациями от 1×10¹ до 1×10⁹ м.к. в 1 мл. Во флаконы вносили по 1 мл взвеси соответствующей концентрации и по 0,2 мл 10% суспензии туляремийного магноиммуносорбента, инкубировали в течение 30-60 мин при комнатной температуре, затем тщательно отмывали и вносили по 200 мкл рабочего разведения пероксидазного туляремийного конъюгата, инкубировали при температуре (37±1)°С в течение 15-20 мин. Промывали 0,1 М фосфатно-солевым буфером с твин-20 не менее 6 раз, используя постоянный магнит. После чего во флаконы вносили по 200 мкл хромогенной смеси. Через 1-2 мин (когда надосадочная жидкость слегка желтела в отрицательном контроле) содержимое флаконов переносили в микропланшеты и останавливали реакцию 50 мкл стоп-реагента (2 М раствором серной кислоты). Для учета результатов производили измерение оптической плотности на приборе "Мультискан" при длине волны 492 нм. Ответ считали положительным при превышении оптической плотности опытного раствора над контрольным (без контакта с антигеном) в 2 и более раза.

В результате установлено, что чувствительность их в 1000 раз выше, чем в традиционном ИФА и составляет 100 м.к./мл.

Для контроля специфичности использовали штаммы культур гетерологичных микроорганизмов, из которых готовили взвеси с концентрацией 1×10⁵ до 1×10⁷ м.к. в пробе. В результате установлено, что при постановке ИФА не отмечалось перекрестных реакций с исследуемыми микроорганизмами.

При проведении статистической обработки по методу Е.П.Тамбовцева с соавт.(1969), в серии опытов титр ИФА равен 0,9×10² м.к./мл (+14,1%; -12,3%).

При селективном концентрировании микроорганизмов на магносорбентах с иммобилизированными на их поверхности специфическими антителами значительно повышается надежность и чувствительность индикации микроорганизмов за счет реакции антиген-антитело.

Пример 2. ИФА проводили аналогично примеру 1, только в качестве исследуемого материала использовали взвесь чумного микроба. Чувствительность в ИФА составила 50 м.к./мл.

Пример 3. ИФА проводили аналогично примеру 1, только в качестве исследуемого материала использовали взвесь туберкулезного микроба. Чувствительность в ИФА составила 50 м.к./мл.

Пример 4. ИФА проводили аналогично примеру 1, только в качестве исследуемого материала использовали взвесь кампилобактерий. Чувствительность в ИФА составила 50 м.к./мл.

Пример 5. ИФА проводили аналогично примеру 1, только в качестве исследуемого материала использовали антиген вируса крымско-геммарогической лихорадки (КГЛ). Чувствительность модифицированного ИФА более чем в 100 раз превышала чувствительность традиционного ИФА на полистироловых планшетах.

Таким образом, изобретение практически осуществимо, его использование позволяет организовать эффективную диагностику особо опасных инфекций, используя в качестве твердой фазы иммобилизованный магносорбент, полученный по экологически безопасной технологии.

Источники информации

1. Дмитриев Г.А., Киселева Т.А. Применение ИФА для серодиагностики сифилиса // Актуальные вопросы дерм. и венер.: Сб.тр. юбил конф., посвящ. 5-летию созд. кож. и вен. болезней педиатр. фак. РГМУ - М., 1997. - С.36-37.

2. Bushway R.J., Perkins L.B., Hurst H.L., Ferguson B.S. // Food chemistry. - 1992. - V.43. - P.283.

3. Voller A., Sidwell D.E., Bartlett A. et al. A microplate enzyme immunoassay for toxoplasma antibody // J. Clin. Pathol. - 1976. - V.29, N 2. - P.150-153.

4. Ефременко В.И., Климова И.М., Трофимов Е.Н. Магнитный иммуноферментный анализ антигенов чумного микроба // Журн. микробиол. - 1989. - №7. - С.62-66.

5. Camargo Z., Guesdon J.L., Drouhet E. Magnetic enzyme-linked immunosorbent assay (Melisa) for determination of specific IgG in paracoccidiodomycosis // Sabouraudia. - 1984. - V.22, N 4. - P.291-299

6. Шаханина К.Л., Соколенко А.А., Павлова И.П. Выбор критериев пригодности твердофазных носителей на основе полистирола для проведения иммуноферментного анализа // Журн. микробиол. - 1987. - N9 - С.86-89.

7. Ометов В.К., Моргуль М.П., Уразовская Е.В. и др. О применении иммуноферментного анализа в диагностике сифилиса // Вестн. дермат. - 1997. - №3. - С.24-35.

8. Калинина О.А., Емельянова И.В., Локтионова М.А. ИФА в серодиагностике сифилиса // Совр. вопр. дермато-венерологии: Сб. юбил науч. тр., посвящ. 70-летию обл.кож.- вен. дисп. г.Курска. - Курск. - 1997. - С.65-67.

9. Киселева И.Н., Беднова В.Н., Дмитриев Г.А. Постановка ИФА для серодиагностики сифилиса // Вести, дерматол. - 1998. - №1. - С.36-42.

10. Ефременко В.И., Климова И.М., Трофимов Е.Н. Магнитный иммуноферментный анализ антигенов чумного микроба // Журн. микробиол. - 1989. - №7. - С.62-66.

11. Дюга Г., Пенни К. Биоорганическая химия. - М., 1983. - С.348, 352.

12. Ефременко В.И., Шаппо С.А., Нарбутович Н.И. и др. Новый метод выделения возбудителя холеры из воды // Особо опасные инфекционные заболевания: диагностика, профилактика и биологические свойства возбудителей: Сб. науч. работ. - Волгоград, 1990. - Вып.4. - С.213-219.

13. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - М., 1982. - С.92.

Изобретение относится к иммунологии. Предложен способ иммуноферментного анализа с использованием оксида железа Fe₂О₃ с иммобилизованными специфическими антителами в качестве магноиммуносорбента. К 0,2 мл 10% суспензии оксида железа Fe₂O₃ с иммобилизованными специфическими антителами вносят по 1 мл взвеси соответствующего антигена и инкубируют смесь в течение 30-60 мин при температуре 22±4°С. Затем проводят отмывку 0,1 М фосфатно-солевым буфером с 0,5% твин-20 с помощью постоянного магнита. Вносят 200 мкл рабочего разведения пероксидазного конъюгата. Инкубируют при температуре 22±4°С в течение 15 мин. Проводят повторную отмывку. Вносят 200 мкл хромогенной смеси и через 1-2 мин переносят содержимое флаконов в микропланшеты и останавливают реакцию внесением по 50 мкл 2 М раствора серной кислоты. Далее проводят учет результатов на спектрофотометре. Использование изобретения позволяет сократить время проведения исследований и повысить срок годности иммобилизованной твердой фазы при высокой чувствительности и специфичности.

Способ иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием магноиммуносорбента (МИС) с иммобилизованными специфическими антителами, отличающийся тем, что в качестве МИС с иммобилизованными специфическими антителами используют оксид железа Fe₂О₃ с иммобилизованными специфическими антителами, при этом к 0,2 мл 10% суспензии оксида железа Fe₂О₃ с иммобилизованными специфическими антителами вносят по 1 мл взвеси соответствующего антигена, инкубируют в течение 30-60 мин, при температуре 22±4°С, проводят отмывку 0,1 М фосфатно-солевым буфером с 0,5% твин-20 с помощью постоянного магнита, вносят 200 мкл рабочего разведения пероксидазного конъюгата, инкубируют при температуре 22±4°С в течение 15 мин, далее проводят повторную отмывку, вносят 200 мкл хромогенной смеси, через 1-2 мин переносят содержимое флаконов в микропланшеты и останавливают реакцию внесением по 50 мкл 2 М раствора серной кислоты, проводят учет результатов на спектрофотометре.