СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАГНОИММУНОСОРБЕНТА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ Российский патент 2005 года по МПК A61K39/02 G01N33/543 

Изобретение относится к иммунохимии, микробиологии и биотехнологии и может быть использовано в получении магноиммуносорбентов для высокочувствительных серологических тест-систем при выявления специфической реакции антиген - антитело при обнаружении бактериальных антигенов с высокой, стабильностью, демонстративностыо, воспроизводимостью и чувствительностью регистрируемых результатов.

Перспективными для применения в методах иммуноанализа являются твердофазные носители, в том числе сорбенты с магнитными свойствами.

Основными требованиями к таким сорбентам являются их инертность по отношению к биологическом препаратам, стабильность свойств, механическая прочность, достаточная сорбциониая емкость при иммобилизации лигандов, невысокая неспецифическая емкость. Более прочное присоединение лигандов к поверхности сорбентов обеспечивается ковалентной связью, которая формируется за счет предварительной активации поверхности сорбентов альдегидами (Ефременко В.И., Пушкарь В.Г. и др. Получение и применение магнитных сорбентов в методах иммуноанализа микроорганизмов // ЖМЭИ. - 1989. - №12. - С.100-104; Ефременко В.И., Кальной С.М. Способ получения сорбентов: Пат. РФ №2070439 С1, 6 В 01 J 20/30, oп. 20.12.96, Бюл. №35).

Иммунологические свойства тест-системы во многом зависят от выбора носителя, на котором иммобилизованы антитела.

Известны различные способы получения иммуносорбентов с магнитными свойствами.

Например, способ эмульсионной полимеризации, в соответствии с которым в реагирующую смесь сомономеров - полиакриламида и катализатора - вносят магнитный порошок и лиганд (иммуноглобулины). При этом происходит механическое включение частиц магнитного порошка и биологически активного вещества (иммуноглобулинов) в ячеистую структуру полиакриламидного геля (Пушкарь В.Г., Трофимов Е.Н. Иммуноферментный анализ антигенного материала, фиксированного на магнитных полиакриламидных сорбентах // Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опасных инфекций. Тезисы докладов Всесоюзной научно-практической конференции (26-27 мая 1986 г.). -Ставрополь, 1986. - Ч II. - С.50-53).

Недостатком этого способа является повышенный расход иммуноглобулинов с концентрацией 40 мг/мл по белку. Это повышает стоимость препарата и ограничивает возможности организации промышленного производства препаратов.

Известен способ получения магносорбента путем предварительной обработки магнитного порошка с приданием ему коррозионной стойкости и гидрофильности с последующим проведением эмульсионной полимеризации смеси сомономеров - полиакриламида и катализатора с обработанным магнитным порошком. Подготовленный магносорбент активируют 5%-ным глутаровым альдегидом в течение 18-20 часов и иммобилизуют специфическими иммуноглобулинами в растворе фосфатно-солевого буфера (ФСБ) при инкубации в течение 18-20 часов. Для блокировки несвязавшихся альдегидных групп магноиммуносорбенты (МИС) дополнительно обрабатывают раствором альбумина в течение 1-3 часов (Пат. РФ №2068703, А 61 К 39/385, С 12 N 11/00 // G 01 N 33/53, oп. 10.11.96; Бюл. №31).

Недостатками этого способа являются многостадийность и длительность процесса получения магноиммуносорбента, использование дорогостоящих и токсичных реактивов, что ухудшает экологические условия производства и ограничивает возможности организации промышленного производства препаратов.

Известно, что в качестве носителей можно использовать магносорбенты (МС), приготовленные на основе алюмосиликата и окиси железа (И.В.Жарникова, Е.Н.Афанасьев, И.С.Тюменцева и др. Способ получения иммуносорбента (Варианты): Пат. РФ №2138813, G 01 N 33/543, А 61 К 39/385 // G 01 N 33/569, С 12 N 11/14, от 27.09.99, Бюл. №27). Тест-системы, изготовленные на их основе, имеют большие преимущества перед традиционными твердофазными иммуноферментными тест-системами за счет повышения чувствительности и сокращения времени постановки реакций (И.В.Жарникова, А.В.Брыкалов, И.С.Тюменцева. Использование композиционных иммуносорбентов в иммуноферментном анализе (ИФА) для экспресс-диагностики возбудителей ООИ // Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний: Материалы межгосударственной науч.- практич. конф., посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы. - Ставрополь, 1994. - С.41-42.).

Недостатком такого типа иммуносорбентов является значительная дисперсность их носителей по размерам и форме, что затрудняет соблюдение строго стандартных условий при постановке реакций в опытных и контрольных объемах.

Известен способ получения биомагносорбента (Кальной С.М., Гончаров В.И. "Способ получения биомагеносорбента". А.с. СССР №2092854 С1, 6 G 01 N 33/554, 1997, от 10.10.97, Бюл. №28), в котором ферромагнетик вводят в предварительно сублимированный биоматериал за счет последовательных жидкостных обработок концентрированными растворами соли сульфата железа (II) и водного раствора аммиака с экспозицией в каждом из растворов в течение 30-50 часов и с сублимацией материала после каждой обработки. Основным недостатком этого способа является необходимость использования сложного и энергоемкого биотехнологического оборудования с соблюдением точных соотношений ингредиентов, используемых для синтеза ферромагнетика.

Наиболее приемлемым носителем являются латексные магноиммуносорбенты (Лукин Ю.В., Егоров В.В., Зубов В.П., Грицкова И.А., Киселев Е.М., Воронов С.А., Пучин В.А. Способ синтеза функциональных магнитных латексов. А.с. СССР №1249024, oп. 10.08.86, Бюл. №29). Для этого синтез магнитных латексов проводят в присутствии коллоидно-дисперсных ферромагнитных частиц оксида железа Fе₃O₄ с переменной валентностью размером 100-250 , стабилизированных олеатом натрия. За счет осмотического насыщения частиц латексов коллоидными растворами оксида железа происходит приобретение последними магнитных свойств.

Недостатком такого способа приготовления МИС является то, что увеличение содержания магнитного материала до 0,33% вес. приводит к значительному увеличению диаметра микросфер от 0,13 до 0,5 мкм и расширению зон распределения частиц по размерам. При более высокой концентрации коллоидно-дисперсных ферромагнитных частиц оксида железа начинают образовываться частицы латексов неправильной формы с различной степенью их наполнения ферромагнитным материалом (Лукин Ю.В., Бахарев В.Н., Зайченко А.С., Воронов С.А., Зубов В.П., Грицкова И.А., Праведников А.Н. Полиакролеиновые латексы: синтез, введение наполнителей и механизм формирования // Доклады Академии наук. - 1985. - Том 285, №1. - С.159-161.).

Целью изобретения является упрощение технологии получения биомагноиммуносорбента на основе полиакролеиновых латексных микросфер с лигированием специфических антител для обнаружения антигенов микроорганизмов в твердофазной иммуноферментной реакции (ИФА).

Технический результат изобретения заключается в повышении стабильности, воспроизводимости, демонстративности и чувствительности результатов реакций серологических тест-систем на основе неорганических МИС и иммуноферментных коньюгатов в ИФА.

Указанный технический результат достигается тем, что предлагаемый способ включает постановку серологической иммуноферментной реакции - ИФА с иммуносорбентом на основе магнитных полиакролеиновых латексных частиц, содержащих оксид железа, и иммуноферментного коньюгата (по типу двойного антительного "сэндвича"), отличающийся тем, что ферромагнитный материал - оксид железа - вводят в микросферы полиакролеиновых магноиммуносорбентов не в момент их синтеза, а после его завершения. Полиакролеиновые магнитные латексные частицы получали за счет образования оксида железа в микросферах полиакролеиновых сорбентов после их синтеза путем последовательной обработки этих суспензий 25-35% растворами сульфата железа (II) в течение 48± 2 часов и 20-25% водным раствором аммиака в течение 48± 2 часов.

Магнитные свойства частицам латексной суспензии придавались за счет образования в них и в основном на их поверхности оксида железа Fе₃O₄, с переменной валентностью и магнитными свойствами. Наряду с другими пористыми сорбентами, к которым относится оксид железа (Неймарк И.Е. Синтетичесие минеральные адсорбенты и носители катализаторов. - Киев: Наукова думка, 1982. - 216 с.), последний обладает высокой пористостью, прочностью, стабилен и хорошо адсорбирует биомакромолекулы. Частицы латексов, содержащие оксид железа, становятся магнитоуправляемыми, обладают хорошей кинетической и агрегативной устойчивостью. По величине дисперсной фазы суспензия магнитных латексов относится к коллоидно-дисперсной группе (величина частиц &λτ; 100, &γτ; 1 мкм, дисперсоиды), имеет одинаковые размеры и однородную форму дисперсной фазы (Адамов А.К., Агафонов В.И. Суспензионные антигены, антитела и иммуносорбенты. - М.: Медицина, 1969. - 176 с.).

По отношению к прототипу, в качестве которого выбран "Способ синтеза функциональных магнитных латексов" (Лукин Ю.В., Егоров В.В., Зубов В.П., Грицкова И.А., Киселев Е.М., Воронов С.А., Пучин В.А) А.с. СССР №1249024, Бюл. №29, от 10.08.86), заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки.

Введение ферромагнитного материала в сформировавшиеся с заведомо заданными размерами и формой полиакролеиновые латексные микросферы приводит к получению монодисперсных и сходных по размерам и форме магноиммуносорбентов с пористой поверхностью, что позволяет их более равномерно в количественном отношении распределять по емкостям в рядах опытных и контрольных проб, что соответственно приводит к стандартизации условий выполнения реакций, повышает чувствительность, воспроизводимость, демонстративность, снижает уровень колебания фоновых значений результатов реакций.

Использование для постановки ИФА полиакролеиновых МИС с приданием магнитных свойств за счет ферромагнитного материала в виде коллоидно-дисперсных растворов оксида железа Fе₃O₄, вводимого в процессе синтеза латексных частиц, повышает вероятность увеличения уровня колебания фоновых значений результатов реакций ввиду наличия в суспензии диагностического препарата значительного количества гетерогенных по размерам и полиморфных микросфер магноиммуносорбентов.

Предлагаемый способ способствует повышению воспроизводимости, стабильности, демонстративности и чувствительности результатов реакций серологических тест-систем на основе магноиммуносорбентов и иммуноферментных конъюгатов, выполняемых по типу двойного антительного сэндвича за счет высокой пористости, прочности, стабильности, хороших адсорбционных свойств в отношении биомакромолекул у оксида железа, увеличивающего удельную поверхность микросфер.

Возможность практического использования заявляемого способа подтверждается примерами конкретного получения полиакролеиновых магноиммуносорбентов для обнаружения бактериальных антигенов.

Пример 1. Полиакролеиновые магнитные латексные частицы получали за счет образования оксида железа в микросферах полиакролеиновых сорбентов после их синтеза путем последовательной обработки 10% - ной суспензии латексов 5-ти кратным 25% раствором соли сульфата железа (II) (FeSO₄·_{7H2O) в течение 48± 2 часов и затем после удаления избытка раствора соли 20% водным раствором аммиака (NH4OH) в течение 48± 2 часов.}

Чумные, туляремийные и бруцеллезные магноиммуносорбенты готовили на основе полученных полиакролеиновых магнитных латексов путем сенсибилизации в течение 24± 2 часов их 10%-ной суспензии видоспецифическими компетентными иммуноглобулинами из чумных, туляремийных или бруцеллезных сывороток с содержанием антител 10 мг/мл. Предварительно поверхность магнитных латексных микросфер активировали 5% раствором глютарового альдегида в течение 4 часов. Для блокировки несвязавшихся альдегидных групп магноиммуносорбенты (МИС) дополнительно обрабатывали раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) в течение 3 часов. После каждой обработки (глютаровым альдегидом, видоспецифиескими иммуноглобулинами, БСА) МИС 5-ти кратно промывали 10-ти кратным объемом 0,01 ФСБ рН 7,2-7,4.

Методика постановки реакции.

Образцы, содержавшие суспензии с концентрацией микробных клеток возбудителя чумы 1× 10⁶, обеззараживали 1% формалином при 56° С в течение 30 мин. Образцы с суспензиями клеток возбудителей туляремии 1× 10⁶ и бруцеллеза 1× 10⁶ обеззараживали кипячением в течение 30-40 мин, исследовали в иммуноферментных тест-системах с пероксидазным коньюгатом по типу двойного антительного "сэндвича". В ряды опытных и контрольных емкостей объемом не менее 0,25 мл вносили по 0,1 мл фосфатно - солевого буферного раствора (ФСБ) рН 7,2-7,4 с 0,05% твин - 20. К содержимому первых опытных емкостей соответственно добавляли по 0,1 мл обеззараженной взвеси микробных клеток чумного, бруцеллезного или туляремийного микробов. Исследуемый материал титровали с коэффициентом 1:2, из последних емкостей избыточный объем 0,1 мл удаляли. В опытные и контрольные ряды емкостей вносили по 0,1 мл 0,5-1,0%-ной суспензии частиц чумного магноиммуносорбентного полиакролеинового диагностикума, суспендированного в 0,01 М ФСБ рН 7,2-7,4 с 0,05% твин - 20.

Опытные и контрольные образцы инкубировали при 37° С в течение 1 часа. Несвязавшиеся с МИС антигены отделяли путем 5-ти кратного промывания 0,01 М ФСБ рН 7,2-7,4 с 0,05% твин - 20.

В ряды опытных и контрольных емкостей вносили чумной, бруцеллезный или туляремийный иммуноглобулиновые пероксидазные конъюгаты в рабочем разведении (соответственно 1:300; 1:400; 1:300) в объеме 0,1 мл на 0,01 М ФСБ рН 7,2-7,4 с 0,05% твин - 20 и 1,0% бычьим сывороточным альбумином (БСА). Опытные и контрольные образцы инкубировали при 37° С. Иммуноферментные конъюгаты, не связавшиеся с антигенами, сорбированными на магноиммуносорбентах, отделяли путем 5-ти кратного промывания 0,01 М ФСБ рН 7,2-7,4 с 0,05% твин - 20.

Во все емкости вносили по 0,1 мл субстрат-индикаторной смеси, представляющей раствор, содержащий 10 мл нитратного буфера рН 5,0, 5 мг ортофенилендиамина и 0,05% перекиси водорода. Все образцы инкубировали при комнатной температуре без доступа света в течение 5-10 мин. Реакцию останавливали внесением в каждую емкость 50 мкл 2,0 М раствора серной кислоты. Учет результатов проводили на приборе "Мультискан" при длине волны 492 нм. Положительным результатом ИФА считалось превышение оптической плотности опытных образцов над оптической плотностью отрицательного контроля в 2 и более раз.

Чувствительность метода составляла 1· 10³-1· 10⁴ м.к./мл для взвесей чумного микроба, 1· 10³-1· 10⁵ м.к./мл - туляремии и 1· 10³-1· 10⁴ м.к./мл - бруцеллеза.

Пример 2. Полиакролеиновые магнитные латексные частицы получали за счет образования оксида железа в микросферах полиакролеиновых сорбентов после их синтеза путем последовательной обработки 10%-ной суспензии латексов 5-ти кратным 35% раствором соли сульфата железа (II) (FeSO₄·_{7Н2О) в течение 48± 2 часов и затем после удаления избытка раствора соли 25% водным раствором аммиака (NH4OH) в течение 48±2 часов.}

Чумные, туляремийные и бруцеллезные магноиммуносорбенты готовили на основе полученных полиакролеиновых магнитных латексов путем сенсибилизации в течение 24± 2 часов их 10%-ной суспензии видоспецифическими компетентными иммуноглобулинами из чумных, туляремийных или бруцеллезных сывороток с содержанием антител 10 мг/мл. Предварительно поверхность магнитных латексных микросфер активировали 5% раствором глютарового альдегида в течение 4 часов. Для блокировки несвязавшихся альдегидных групп магноиммуносорбенты (МИС) дополнительно обрабатывали раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) в течение 3 часов. После каждой обработки (глютаровым альдегидом, видоспецифиескими иммуноглобулинами, БСА) МИС 5-ти кратно промывали 10-ти кратным объемом 0,01 ФСБ рН 7,2-7,4.

Методика постановки реакции.

Постановка ИФА аналогична методике, описанной в примере 1, за исключением полученных результатов учета реакций.

Чувствительность метода составляла 1· 10²-1· 10³ м.к./мл для взвесей чумного микроба, 1· 10²-1· 10⁴ м.к./мл - туляремии и 1· 10³-1· 10⁴ м.к./мл бруцеллеза.

Учет результатов проводили на приборе "Мультискан" при длине волны 492 нм. Положительным результатом ИФА считалось превышение оптической плотности опытных образцов над оптической плотностью отрицательного контроля в 2 и более раз. В каждом случае постановки ИФА оптическая плотность опытных образцов превышала оптическую плотность отрицательного контроля в 6-8 раз, что доказывает демонстративность реакций с использованием разработанных МИС. Чумные, туляремийные и бруцеллезные жидкие МИС хранили в холодильнике в течение 2 лет (срок наблюдения) с проверкой их качества каждые 6 месяцев. Препараты оставались стабильными без утраты специфической активности в течение всего срока наблюдения, в то время как не фиксированные на твердой матрице "Ig" теряют специфическую активность при тех же условиях хранения в течение 7 суток. Это доказывает стабильность препаратов.

Чувствительность метода составляла 1· 10²-1· 10³ м.к./мл для взвесей чумного микроба, 1· 10²-1· 10⁴ м.к./мл - туляремии и 1· 10³-1· 10⁴ м.к./мл бруцеллеза, при высокой демонстративности, воспроизводимости и стабильности результатов реакций. Это было обусловлено значительно меньшим колебанием (на 40-60%) фоновых значений результатов иммуноферментных реакций.

Как показали результаты экспериментальных исследований, экспозиция полиакролеиновых латексных микросфер в каждом из растворов ингредиентов менее 48± 2 часов не приводит к образованию частиц с удовлетворительным магнитным моментом. Увеличение времени экспозиции латексов в растворах ингредиентов более 40± 2 часов не улучшает магнитные качества носителей.

Снижение концентраций растворов ингредиентов при обработке латексов ниже 25% для FeSO₄·_{7H2O и ниже 20% для NH4OH приводит к уменьшению магнитного момента у частиц. Увеличение концентрации раствора соли сульфата железа (II) выше 35% требует увеличения температуры жидкости, что усложняет технологию.}

Соотношения объемов суспензии латексов и обрабатывающих жидкостей составляет 1:4-1:5 и является существенным условием получения качественных носителей, способствующих их более равномерному насыщению ионами растворов за счет эффективного выравнивания осмотического давления.

Таким образом, заявляемый способ практически осуществим и имеет преимущество перед прототипом, так как обеспечивает упрощение биотехнологии получения серологической тест-системы для обнаружения бактериальных антигенов с высокой чувствительностью и большей воспроизводимостью, стабильностью и демонстративностью регистрируемых результатов реакций.

Изобретение относится к иммунологии. Способ включает синтез магнитных латексов в присутствии коллоидно-дисперсных ферромагнитных частиц оксида железа, при этом оксид железа вводят в микросферы полиакролеиновых сорбентов после их синтеза. Способ позволяет упростить технологию получения серологической тест-системы.

Способ получения магноиммуносорбента для обнаружения бактериальных антигенов, включающий синтез магнитных латексов в присутствии коллоидно-дисперсных ферромагнитных частиц оксида железа, отличающийся тем, что оксид железа вводят в микросферы полиакролеиновых сорбентов после их синтеза путем последовательной обработки суспензией 25-35%-ными растворами сульфата железа (II) в течение (48±2) ч и 20-25%-ными водным раствором аммиака в течение (48±2) ч, при этом объемы суспензии латексов и обрабатывающих жидкостей составляют 1:4-1:5.