СПОСОБ ИНДИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2001 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при выявлении патогенных микроорганизмов при их низких концентрациях в объектах внешней среды.

Традиционные способы выявления патогенных микроорганизмов в объектах внешней среды предусматривают взятие пробы из определенных мест в стерильную посуду и направление ее в лабораторию для анализа (Справочник под ред. М.О. Биргера. М., "Медицина", 1973, с. 387).

Однако эти способы не обеспечивают надежности выявления патогенных микроорганизмов, так как в силу их низкой концентрации они могут и не попасть в пробу. Кроме того, для проведения анализа на наличие инфекции требуется подращивание культуры, что требует больших временных и материальных затрат.

В силу наличия посторонней микрофлоры специфичность реакции антиген-антитело невысока, зачастую получаются ложноположительные или ложноотрицательные результаты.

И, наконец, проведение реакции антиген-антитело обеспечивает только данные о наличии или отсутствии микроорганизма. Для определения эпидзначимости инфекции и принятия решения о необходимых мероприятиях требуются дальнейшие длительные исследования.

С развитием разработок по получению и использованию в микробиологии магноиммуносорбентов значительно расширились возможности выделения патогенных микроорганизмов из воды путем их селективного концентрирования на поверхности магноиммуносорбентов.

Известен набор устройств и приспособлений для различных манипуляций с магноиммуносорбентами: для забора, транспортировки и хранения проб, для отделения магноиммуносорбента от жидкой фазы, для проведения иммунохимического анализа (Патент РФ N 2098828, G 01 N 33/553, C 12 M 1/00, 10.12.97, Бюл. N 34).

При селективном концентрировании микроорганизмов на магносорбентах с иммобилизованными на их поверхности соответствующими антителами значительно повышается надежность и чувствительность индикации микроорганизмов в объектах внешней среды за счет реакции антиген-антитело.

Однако такие методы обнаружения могут использоваться для установления присутствия или отсутствия патогенных бактерий, для определения же их эпидзначимости требуются дальнейшие исследования.

В последнее время интенсивно развиваются работы по детекции патогенной микрофлоры по генетической идентификации клеток с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

В основе ПЦР лежит амплификация участка генома путем многократного копирования специфичной для данного микроорганизма нуклеотидной последовательности.

Реакция осуществляется при помощи фермента термостабильной ДНК-полимеразы (Тад-полимеразы) и комплементарных ДНК-мишени олигонуклеотидных праймеров. Образование в результате реакции фрагментов ДНК определенного размера оценивается как факт наличия в пробе клеток искомого микроба или позволяет идентифицировать исследуемую ДНК. (Методические указания по детекции патогенной микрофлоры в клиническом материале, пищевых продуктах, объектах внешней среды и выполнение генетической идентификации клеток с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), М., 1996 г.).

При использовании этого способа для индикации патогенных микроорганизмов в объектах внешней среды возникает ряд трудностей.

В связи с высокой чувствительностью ПЦР возникает проблема, связанная с тем, что в пробах исследуемого материала присутствуют различные посторонние компоненты микрофлоры, отдельные фрагменты генетического материала, что снижает достоверность способа. Способ требует тщательной подготовки исследуемого материала. Аналитическая чувствительность способа в зависимости от вида инфекции составляет 100-1000 м.к./мл. Поэтому при низких концентрациях микроорганизма требуется подращивание культуры.

Проведен ряд исследований оп объединению иммуномагнитной сорбции и ПЦР с последующей гибридизацией ДНК-зондом для обнаружения бактерий в клинических обследованиях оральной микрофлоры, мочи, фекалий. На магнитные носители наносили специфические иммуноглобулиновые фракции или моноклональные антитела и инкубировали их в бактериальных суспензиях.

Носители со связанными антигенами кипятили, и в супернатанте амплифицировали ДНК-мишени с последующей идентификацией специфических фрагментов (Oral. Mucrobiol. Immunol. , 1997, Oct. 12 (5) p. 311-317; J. Clin. Microbiol, 1995, Nov. 33 (11), p, 2908-2912; PCR Methods Appl; 1992, Nov. 2 (2), p. 167-171; J. Clin. Microbiol., 1992, Nov. 30 (11), p. 2801-2806).

Результаты исследований показывают значительное сокращение времени обнаружения бактерий (до 7 ч ) по сравнению с традиционными методами. Кроме того повышается специфичность индикации микроорганизмов.

Например, при обследовании наличия в оральной микрофлоре Bacteroides forsythus иммунофлуоресцентным методом положительная реакция наблюдалась у 62% пациентов, а иммуномагносорбент-ПЦР-ДНК - у 82%.

Однако использование такого способа при обследовании большого количества объектов внешней среды с целью выявления источника инфекций, особенно при возникновении экстремальной ситуации эпидемий, экономически не целесообразно в связи с высокой стоимостью тест-систем для проведения ПЦР.

Наиболее близким к заявляемому по назначению является способ выявления вируса гепатита A в объектах внешней среды (Патент РФ N 2065164, G 01 N 33/53, 10.08.96, Бюл. N 22).

Способ включает селективное концентрирование вируса на магносорбентах, сенсибилизированных антигепатитными иммуноглобулинами, с помощью магнитных ловушек, расположенных в объектах внешней среды (водопроводные трубы, канализационные стоки, водоемы), с последующей детекцией наличия вируса иммуноферментным анализом.

При своей надежности и чувствительности этот способ недостаточен для выявления в объектах внешней среды таких опасных инфекций, как холера, чума, бруцеллез, сибирская язва, туляремия, так как иммуноферментный анализ фиксирует только наличие или отсутствие определенного микроорагнизма в пробе, для оценки их вирулентности требуются дальнейшие исследования.

Целью изобретения является разработка надежного, достаточно чувствительного и кратковременного, безопасного для обслуживающего персонала способа индикации микроорганизмов в объектах внешней среды при их низкой концентрации с одновременным определением их эпидзначимости.

Поставленная цель достигается тем, что способ индикации микроорганизмов включает их селективное концентрирование на магноиммуносорбентах с последующей детекцией реакции антиген-антитело и осуществление в пробах с положительной реакцией антиген-антитело ПЦР с определением генетических детерминант патогенности.

Отличительным признаком заявляемого способа является осуществление в пробах с положительной реакцией антиген-антитело ПЦР с определением генетических детерминант патогенности. Это обусловлено тем, что чувствительность ИФА, РИФ с использованием в качестве твердой фазы магноиммуносорбентов и ПЦР в достаточной степени сопоставимы. Ограничение использования ПЦР только для определения детерминант патогенности в заведомо положительных пробах значительно удешевляет индикацию патогенных микроорганизмов в объектах внешней среды.

Использование ПЦР в совокупности с селективным концентрированием микроорганизмов на магноиммуносорбентах с предварительной детекцией положительных проб реакций антиген-антитело обеспечивает достаточно оперативную информацию не только о наличии, но и вирулентности возбудителя при его низкой концентрации в объектах внешней среды для принятия решения о целесообразности эпидемиологических мероприятий.

Сочетанное использование магноиммуносорбентов и ПЦР повышает чувствительность ПЦР, так как исключается попадание в пробу отдельного генетического материала в результате аутолиза и других причин.

Совокупность генетического и иммунохимического метода с реакцией антиген-антитело значительно повышает достоверность индикации.

Способ выполняется следующим образом.

Забор проб из водоемов, канализационных стоков, рек, водопроводов осуществляют с помощью приспособлений для забора, хранения и транспортировки проб, представляющих цилиндрический корпус с магнитной пробкой, с примагниченными на ее поверхности магносорбентами, сенсибилизованными высокоспецифическими антителами холеры, чумы, туляремии (Патент РФ N 2098828, G 01 N 33/553, C 12 M 1/00, 10.12.97, Бюл. N 34). Заряженный магноиммуносорбентом корпус помещают в исследуемый объект на 24 ч.

При селектировании микроорганизмов из суспензий почв, блох и т.п. суспензия пропускается через магносорбенты, сенсибилизированные антителами к сибирской язве, чуме, туляремии, через систему фильтров в проточном режиме в течение 2 ч.

Магноиммуносорбенты с сорбированными на них клетками отделяются от магнитной пробки и направляются на иммуноферментный анализ для детекции реакции антиген-антитело.

Пробы с положительной реакцией подвергаются лизированию кипячением, центрифугированию, супернатант исследуется в ПЦР праймерами к хромосомальной последовательности по известным тест-системам.

Экспериментально установлена принципиальная возможность сочетания магноиммуносорбентов и ПЦР для обнаружения различных инфекций и проверена сорбционная способность магноиммуносорбентов с антителами к антигенам, что показано в примерах.

Пример 1.

В опыте использовали токсигенный штамм Vibrio cholerae eltor в исходной концентрации 1 микробная клетка в 1 мл физиологического раствора. Через стеклянную трубку, заполненную холерным магноиммуносорбентом (МИС), представляющим собой композиционные магнитные гранулы с иммобилизированными на их поверхности О-холерными иммуноглобулинами, последовательно самотеком пропускали 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 мл исходной микробной взвеси. После прохождения каждой порции сорбент заменяли. МИС с сорбированными на нем клетками затем трижды отмывали физиологическим раствором для исключения неспецифической сорбции и обеззараживания кипячением. По этому принципу готовили 2 одинаковые пробы. Одна проба использовалась в иммуноферментном анализе (ИФА), вторая - в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для ПЦР кипячение служило одновременно и способом лизиса клеток.

Первоначально все пробы исследовали методом ИФА согласно общепринятой методике (Ефременко В.И. Магносорбенты в микробиологических исследованиях. - Ставрополь, 1996. - С. 94-103).

В исходном растворе (1 м.к./мл) и в пробах, содержащих 100, 200, 300 клеток (количество клеток в пробе соответствует объему исходного раствора, прошедшего через МИС), холерный вибрион методом ИФА не обнаружен. В пробах от 400 до 2000 клеток результаты ИФА показывали наличие клеток V. cholerae.

В ПЦР использовали супернатант после центрифугирования только положительных в ИФА проб. Исследования проводили согласно "Инструкции по применению тест-системы для выделения Vibrio cholerae (Tox +) методом ПЦР" (изготовитель тест-системы ВНИПЧИ "Микроб"). Методом детекции служил электрофорез в агарозе. Электрофоретические полосы образцов после амплификации в пробах от 400 до 2000 клеток соответствовали полосе гена токсигенности V. cholerae.

Таким образом, холерный вибрион без предварительного подращивания обнаружен в пробе небольшого объема (400 мл) с низкой концентрацией микроба (1 м. к./мл) с одновременным определением детерминант патогенности.

Пример 2.

В опыте использовали культуру штамма чумного микроба, выращенного при 37^oC в течение 48 ч. Приготавливали суспензии микроба с концентрациями 1·10², 2·10², 5·10², 8·10², 1·10³ м.к./мл. Во флаконы вносили по 1 мл взвеси соответствующей концентрации чумного микроба и по 0,2 мл 10% суспензии магноиммуносорбентов, инкубировали в постоянном магнитном поле в течение 1,5 ч при комнатной температуре, затем 4-5 раз отмывали физиологическим раствором. Все образцы после обеззараживания направляли на ИФА. Положительные пробы заливали дистиллированной водой и кипятили в течение 15 мин, центрифугировали и супернатант подвергали ПЦР. ПЦР проводили согласно "Инструкции по применению тест-системы для обнаружения ДНК чумного миркоба" (ВНИПЧИ "Микроб").

Детекция чумного микроба в ИФА и ПЦР происходит в пробах 2·10² м.к./мл и далее.

Пример 3.

В опыте использовали суспензию туляремийного микроба в концентрации 1 м. к. /мл. Через стеклянную трубку, заполненную туляремийным магноиммуносорбентом, самотеком пропускали последовательно 100, 200, 300, 800, 1000, 2000 мл взвеси. После прохождения каждой порции магноиммуносорбент заменяли. Полученные пробы магноиммуносорбентов с сорбированными на них микробными клетками трижды отмывали физиологическим раствором при pH 7,2-7,4, обеззараживали и исследовали в ИФА. Затем пробы с положительным результатом заливали дистиллированной водой, кипятили 30 мин, центрифугировали и супернатант подвергали ПЦР.

ПЦР проводили согласно "Инструкции по применению тест-системы для обнаружения ДНК туляремийного микроба" (ВНИПЧИ "Микроб").

Детекция туляремийного микроба в ИФА и в ПЦР происходила в пробах 800, 1000, 2000 мл.

Таким образом, туляремийный микроб обнаружен в 800 мл микробной взвеси концентрации 1 м.к./мл с одновременным определением детерминант патогенности.

Пример 4.

В опыте использовали патогенный штамм Br. abortus в концентрации 1 м.к. /мл. Через стеклянную трубку, заполненную бруцеллезным МИС, самотеком пропускали последовательно 100, 200, 300, 400, 500, 1000 и 2000 мл исходного раствора. Опыт проводили в двух повторах. После прохождения каждой порции МИС заменяли. Полученные пробы трижды отмывали физиологическим раствором с pH 7,2-7,4. Пробы направляли на ИФА, затем пробы с положительным результатом заливали дистиллированной водой, кипятили в течение 60 мин, центрифугировали и супернатант подвергали ПЦР.

ПЦР проводили согласно "Инструкции по применению тест-системы для обнаружения ДНК бруцелл" (ВНИПЧИ "Микроб").

Детекция бруцеллезного микроба в ИФА и ПЦР происходила в пробах, начиная со 100 мл.

Пример 5.

К взвесям спор B. antracis, содержащим 10, 50, 100, 250, 500, 1000 и 2000 спор в 1 мл, добавляли 5 мкл 10% суспензии сибиреязвенных магноиммуносорбентов и выдерживали в течение 2 ч при комнатной температуре при периодическом перемешивании встряхиванием. Затем магноиммуносорбенты отмывали, переносили в пробирки Эппендорф с 1 мл бульона Хоттингера и инкубировали при 37^oC 1,5 ч. Пробы исследовали с помощью РИФ и ИФА. Положительные результаты были получены при наличии 500 и более спор B. antracis в 1 мл исследуемой взвеси. В положительных пробах клетки лизировали кипячением, центрифугировали и супернатант исследовали в ПЦР с праймерами к хромосомальной последовательности Ba 813 (Patrei et al., 1996) и последовательностям плазменных генов pag и cap B (Тучков и Куличенко, 1994; Beyer et al., 1996). Амплификацию проводили в амплификаторе "Perkin Elmer "2400".

Детекция сибиреязвенного микроба происходила в пробах той же концентрации, что и в ИФА и РИФ при одновременном определении детерминант патогенности.

Аналогичные результаты были получены при исследовании вытяжки из садовой почвы, искусственно контаминированной приведенными выше концентрациями спор.

По отношению к известным решениям совместного исследования МИС и ПЦР заявляемый способ имеет преимущества, а именно: возможность исследования проб с высокой степенью загрязненности, возможность забора проб неограниченного объема из объектов внешней среды, значительное удешевление индикации. Применение МИС позволяет осуществлять селективное концентрирование возбудителей из проб с низкой концентрацией микроорганизмов, например, 1 микробная клетка в мл, при которой данный возбудитель не определяется ни одним из методов.

По чувствительности предлагаемый способ превосходит индикацию ПЦР с традиционным взятием проб не менее чем в 100 раз.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при выявлении патогенных микроорганизмов при их низких концентрациях в объектах внешней среды. Способ включает селективное концентрирование патогенных микроорганизмов на магноиммуносорбентах с последующей детекцией реакции антиген-антитело, а затем - осуществление в пробах с положительной реакцией антиген-антитело полимеразной цепной реакции (ПЦР) с определением генетических детерминант патогенности. Это обеспечивает ускорение и повышение надежности индикации патогенных микроорганизмов. Особенно это важно для индикации микроорганизмов особо опасных инфекций в низких концентрациях с одновременным определением детерминант патогенности.

Способ индикации микроорганизмов, включающих их селективное концентрирование на магноиммуносорбентах, отмывку проб с последующей детекцией реакции антиген-антитело, отличающийся тем, что отмытые пробы подвергают кипячению в воде и при положительной реакции антиген-антитело осуществляют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с определением генетических детерминант патогенности.