СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКЗОТОКСИНСОДЕРЖАЩЕГО ПРЕПАРАТА В КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ BACILLUS THURINGIENSIS Советский патент 1995 года по МПК A01N63/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при изготовлении экзотоксинсодержащих биологических препаратов средств защиты растений.

Бета-экзотоксин (далее экзотоксин) синтезируется культурой B. thuringiensis в процессе культивирования. Его содержание достигает 0,4 г/л в культуральной жидкости и 0,8% в сухом концентрате.

Известен способ получения экзотоксина, который заключается в отделении остатков питательной среды центрифугированием, внесением в супернатант гидроксида кальция и высушиванием фугата. Недостатками данного способа являются невозможность получения препарата с концентрацией экзотоксина более 2 мас.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения экзотоксина, заключающийся в отделении остатков питательной среды центрифугированием (фильтрованием) и осаждении экзотоксина хлористым барием с последующим переводом бариевого осадка в растворимое состояние. Недостатками данного способа являются невозможность получения препарата с высокой концентрацией экзотоксина (более 30 мас.).

Целью изобретения является увеличение содержания экзотоксина в препарате.

Поставленная цель достигается тем, что концентрат остатков питательной среды, полученный фильтрацией, диафильтруют водой, экзотоксин осаждают ацетатом бария с концентрацией не менее 3 г на 1 г экзотоксина при рН 8,0-9,5, бариевый осадок концентрируют на ультрафильтрах с последующей диафильтрацией аммиачным водным раствором с рН 9,5-10,0 и растворяют в водном растворе углекислого аммония с рН 9,3-9,5 и концентрацией не менее 4 г на 1 г ацетата бария, полученный раствор концентрируют на ультрафильтрах и диафильтруют водой при 58-80^оС.

Данный способ в отличие от известного позволяет получить концентрацию экзотоксина в сухом препарате до 60 мас. и снизить потери при получении препарата до 8%
Сущность данного изобретения заключается в применении мембранных методов разделения для отделения экзотоксина от балластных нуклеотидов.

Осаждение экзотоксина ацетатом бария с концентрацией не менее 3 г ацетата бария на 1 г экзотоксина при рН 8,0-9,5 позволяет наиболее полно связывать экзотоксин, сместив равновесие реакции в сторону образования экзотоксинбариевого комплекса, и тем сократить потери экзотоксина.

Концентрирование бариевого осадка экзотоксина с последующей диафильтрацией аммиачным водным раствором с рН 9,5-10,0 позволяет провести очистку бариевого осадка экзотоксина от балластных нуклеотидов, не разрушая при этом комплекса экзотоксин-барий, что повышает содержание экзотоксина.

Перевод бариевого осадка экзотоксина в растворимое состояние насыщенным аммиачным водным раствором углекислого аммония с рН 9,3-9,5 и концентрацией не менее 4 г углекислого аммония на 1 г ацетата бария позволяет наиболее полно перевести экзотоксин в растворимое состояние, так как в указанном диапазоне рН раствора происходит смещение равновесия реакции в сторону образования углекислого бария.

Удаление образующейся соли углекислого бария концентрированием раствора на ультрафильтрах с последующей диафильтрацией концентрата водой при 58-80^оС позволяет с минимальными потерями выделить экзотоксин из раствора и одновременно удалить остатки углекислого аммония. Разложение (NH₄)₂CO₃_→ CO₂+ H₂+NH₃ происходит при температуре более 58^оС. Однако при 80^оС при данном рН 9 происходит образование лактонной формы экзотоксина, слабо активной для насекомых, поэтому повышение температуры нежелательно.

Содержание экзотоксина определялось с помощью тонкослойной хроматографии и спектрофотометрии.

П р и м е р 1. Культивирование микроорганизмов В. thuringiensis v. thuringiensis штамм 98-1 проводили в ферментаторе емкостью 8 л на дрожжеполисахаридной среде (ДПС) следующего состава, Кормовые дрожжи 3 Кукурузная мука 1,5
Синтетический пеногаситель 0,08
Режим культивирования: Температура, ^оС 28-30
Частота вращения мешалки, об/мин 200-300
Избыточное давление, атм 0,4-0,5 Расход воздуха, л/ч 0,1
Содержание сухих веществ в полученной культуральной жидкости (КЖ) составляло 2,7 г/л рН 6,0+0,5, содержание экзотоксина 0,2 г/л, число жизнеспособных спор 4,0 млрд./мл. Концентрирование и диафильтрацию проводили на ультрафильтрах с размером пор по пропусканию белка 10000 Да в следующем режиме:
Скорость тангенциального потока, мк 2-5
Трансмембранное давление, МПа 0,2-0,3
Фильтрующая поверхность, м² 0,2 Температура, ^оС 2,5 + 5
Культуральная жидкость концентрировалась на ультрафильтрах 6 раз, концентрат диафильтровался 2-кратным объемом воды. К 30 л фильтрата добавлялось 90 мл 20%-ного водного раствора ацетата бария (3 г ацетата бария на 1 г экзотоксина), рН раствора доводился до 8,0 ед. рН 25%-ным водным раствором аммиака.

Выбор концентрации в диапазоне рН водного раствора ацетата бария проведен на основании данных, представленных в табл. 1-3.

Бариевый осадок экзотоксина концентрировался на ультрафильтрах в 8 раз с последующей диафильтрацией 3-кратным объемом аммиачного водного раствора с рН 9,5. Затем к концентрату добавлялось 0,5 л аммиачного водного раствора углекислого аммония с рН 9,3, полученный раствор концентрировался в 15 раз на ультрафильтрах при 80^оС, диафильтровался 0,5 л воды и лиофильно высушивался.

Перевод бариевого осадка экзотоксина в растворимое состояние аммиачным водным раствором углекислого аммония с рН 9,3-9,5 и концентрацией не менее 10 г углекислого аммония на 1 г экзотоксина позволяет наиболее полно перевести в растворимое состояние, так как в указанном диапазоне рН раствора происходит смещение равновесия реакции в сторону образования углекислого бария (см. табл. 4). В табл. 4 приведены потери экзотоксина в зависимости от концентрации и рН углекислого аммония. Концентрация ацетата бария 9,5 г рН аммиачного водного раствора 3,0.

Содержание экзотоксина в сухом препарате составило 60 мас. ЛК-50 на личинках колорадского жука 0,004% Потери экзотоксина на всех этапах концентрирования не превысили 8%
П р и м е р 2. Культивирование микроорганизмов B. thuringiensis v. thuringiensis штамм 202-1С проводили в ферментаторе объемом 8 л на поликомпонентной питательной среде (ППС) следующего состава, Кормовые дрожжи 2,8 Кукурузная мука 1,4 Хлористый кальций 0,3
Гидролизат хлопкового шрота 3,0 Зеленая патока 1,0
Синтетический пеногаситель 0,03
Режим культивирования тот же, что и в примере 1.

Содержание сухих веществ в полученной КЖ 0,21 г/л, рН 6,0 + 0,5. Содержание экзотоксина 0,28 г/л, число жизнеспособных спор 4,5 млрд.спор/мл.

К 30 л фильтрата с содержанием экзотоксина 28 г/л добавлялось 100 мл 20% -ного водного раствора ацетата бария (3,9 г ацетата бария на 1 г экзотоксина), рН раствора доводился до 9,5 ед. рН 25%-ным водным раствором аммиака. Осадок концентрировался на ультрафильтрах в 20 раз с последующей диафильтрацией 8-кратным объемом аммиачного водного раствора с рН 10,0. Бариевый осадок растворялся в 2 л аммиачного водного раствора углекислого аммония с рН 9,5 и концентрировался на ультрафильтрах в 20 раз при 58^оС с последующей диафильтрацией 0,5 л воды и лиофильно сушился.

Выбор технологических режимов, обеспечивающих получение максимальной концентрации экзотоксина обоснован в табл. 5-8.

В табл. 8 приведены потери экзотоксина в зависимости от концентрации и рН углекислого аммония, концентрация ацетата бария 9,5 г, рН аммиачного водного раствора 3,0.

Содержание экзотоксина составило 61 мас. в сухом препарате ЛК-50 на личинках колорадского жука 0,004% Потери экзотоксина на всех этапах концентрирования не превысили 8%
В табл. 9 для сравнения представлены основные характеристики препаратов, а именно полученных содержание экзотоксина в сухом препарате. ЛК-50 на личинках комнатной мухи препаратов, полученных на двух питательных средах и с помощью двух штаммов-продуцентов по предлагаемой технологии (1) и по известной технологии (2).

Основное преимущество данного способа возможность получения экзотоксина с концентрацией 600 г/кг (или содержание экзотоксина в препарате 60 мас.), а согласно известному способу можно получить препарат с содержанием экзотоксина не более 28 мас.

Потери экзотоксина, полученного данным способом, не превышают 8% (выход 92%).

Диафильтрация водой способ проведения процесса мембранного разделения с непрерывным или периодическим добавлением воды в разделяемую смесь.

Таким образом, использование предлагаемого способа получения инсектицидного биопрепарата обеспечивает следующие преимущества: сокращение потерь экзотоксина на 50%
увеличение содержания экзотоксина в препарате до 60 мас. что делает его конкурентноспособным с аналогом AG 6146 (США), содержащим до 55 мас. экзотоксина.

Использование: микробиологическая промышленность, получение средств защиты растений от вредных насекомых экзотоксинсодержащего препарата. Сущность изобретения: культуральную жидкость концентрируют на ультрафильтрах и диафильтруют полученный концентрат водой. К фильтру добавляют раствор ацетата бария из расчета не менее 3 г на 1 г экзотоксина при pH 8,0-8,5. Бариевую соль экзотоксина отделяют на ультрафильтре и диафильтруют аммиачным раствором с pH 3,5-10. К концентрату добавляют углекислый аммоний для растворения осадка и полученный раствор вновь концентрируют на ультрафильтре при 58-80°С, дифильтруют водой и высушивают лиофильно. Способ позволяет увеличить содержание препарата с 280 до 600-610 г/л и увеличить ЛК 50 с 0,01 до 0,004 (на комнатной мухе). 9 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКЗОТОКСИНСОДЕРЖАЩЕГО ПРЕПАРАТА В КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ BACILLUS THURINGIENSIS, предусматривающий удаление твердых остатков, осаждение экзотоксина солью бария при щелочных значениях рН, отделение полученного осадка в виде бариевой соли экзотоксина, растворение его в растворе углекислого аммония, удаление аммония, отделение жидкой фракции, содержащей целевой продукт, и высушивание, отличающийся тем, что, с целью повышения концентрации экзотоксина в целевом продукте, удаление твердых остатков из культуральной жидкости осуществляют одновременно с концентрированием ультрафильтрацией и диафильтрацией водой, из солей бария используют ацетат бария, который вносят из расчета 3 5 г на 1 г экзотоксина, отделение бариевой соли экзотоксина осуществляют одновременно с концентрированием его ультрафильтрацией и диафильтрацией аммиачным раствором рН 9,5 10, углекислый аммоний вносят из расчета 4 5 г на 1 г ацетата бария рН 9,3 9,5, удаление углекислого аммония и отделение жидкой фракции осуществляют одновременно путем ультрафильтрации при 58 80^oС с последующей диафильтрацией водой.