ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS FLUORESCENS, РАЗЛАГАЮЩИЙ СТИРОЛ И ЭТИЛБЕНЗОЛ Российский патент 1996 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 C12R1/39 C02F3/34 

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий Pseudomonas fluorescens ВКПМ-6477, способного с высокой скоростью осуществлять разложение стирола и этилбензола. Стирол и этилбензол токсичные соединения, применяются при производстве полистирола и бутандиенстирольного каучука. Стирол входит в состав универсальных клеев полиэфирных лаков, применяющихся при облицовке мебели, изготовлении и отделке древесных плит. При этом стирол и этилбензол содержатся в воздушных выбросах. Штамм может использоваться в биореакторах для микробиологической очистки газовоздушных выбросов. Известны различные штаммы бактерий, способные разрушать ароматические соединения, например, стирол разрушается одним из штаммов рода Xanthobacter [1] этилбензол различными видами рода Nocordia [2]
Наиболее близким к изобретению является штамм бактерий, относящийся к роду Pseudomonas, а именно Pseudomonas aeruginosa ВКМ-1611Д, разлагающий метилстирол и толуол [3] Штамм выделен из сточных вод производства синтетического каучука, использует метилстирол и толуол в качестве единственного источника углерода и энергии при их содержании в растворе в количестве 10 г/л и 4 г/л соответственно.

Задача изобретения получение нового штамма бактерий, способных эффективно осуществляют деградацию стирола и этилбензола.

Штамм Pseudomonas fluorescens ВКПМ-6477 выделен из загрязненных нефтью почв и отобран путем длительной экспериментальной адаптации к этилбензолу. Первоначально выделенный по способности расти на минеральной среде в парах этилбензола, штамм был подвергнут дальнейшим пересевам для отбора по скорости роста в парах этилбензола. Полученные колонии пересевали на минеральную среду и выращивали в парах стирола. Отобранные колонии пересевали в жидкие среды со стиролом и этилбензолом в качестве единственных источников углерода в концентрации 20 г/л и 5 г/л соответственно. Предлагаемый штамм был отобран как наиболее активно растущий на стироле и этилбензоле, присутствующих в среде как вместе, так и отдельно, и осуществляющий их полную деградацию до CO₂ и H₂O.

В биореакторах для очистки воздуха штамм может поглощать до 80 мг стирола и 10 мг этилбензола на г сухой биомассы одновременно.

Характеристика штамма Pseudomonas fluorescens ВКПМ-6477.

Среда для хранения: МПА и минеральная среда, содержащая 0,01 фенилуксусной кислоты.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки грамотрицательные, неспорообразующие подвижные палочки размером 0,5 >0,7 х 1 2 мкм у 24-часовой культуры, выросшей на МПБ. Рост на МПБ с образованием пленки белого цвета и небольшим выделением газа. На МПА колонии на 7 10-е сут роста мелкие, округлые диаметром 0,2 0,4 мм, гладкие, блестящие, плоские, с ровным краем, кремовые.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб, растет при 25 29^oC, оптимальное значение рН среды 6,8 - 7,5.

Нитраты восстанавливает, желатину не разжижает, крахмал не гидрализует, ацетоны и не образует.

Обладает оксидазной, каталазной и липазной активностями.

На средах, содержащих органическую среду, выделяет сероводород.

На среде КИНГА флуоресцирующий пигмент не образует.

Усваивает глюкозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, арабинозу, рамнозу, ксилозу. Подкисляет среду при росте на глюкозе, ксилозе, арабинозе.

Из спиртов усваивает дульцит, инозит, маннит, сорбит, глицерин, слабо этанол.

Усваивает 1-фенилэтанол, фенилуксусную кислоту, ацетофенон, салициловую кислоту.

При выращивании на минеральной среде со стиролом или этилбензолом использует эти соединения в качестве единственных источников углерода и энергии.

Промышленная применимость штамма подтверждается следующими примерами.

П р и м е р 1. Штамм Pseudomonas fluorescens ВКПМ 6477 выращивают на твердой минеральной среде в парах стирола в течение 4 сут. Суспензией выросшей культуры засевают колбы емкостью 300 мл с 50 мл среды, следующего состава, г/л:
(NH₄)2SO₄ 2,0; Na₂HPO₄ x 12H₂O 6,8; KH₂PO₄ 3,4; MgSO₄ 0,2; FeSO₄ 0,002; CaCl₂ 0,026; микроэлементы, г/л: MnCi₂ 1,5; Na₂MoO₄ 0,30; CuSO₄ 0,25; H₃PO₃ 0,28; ZnSO₄ 0,25; рН 7,2 7,4.

Стирол вносят в колбу в количестве 2 Культуру выращивают на качалке при 220 об/мин и температуре 28^oC в течение суток. Выход биомассы 2 г/л (по сухому весу), что сравнимо с количеством биомассы, накапливаемой культурой при ее выращивании на глюкозе.

П р и м е р 2. В лабораторную установку-биореактор с орошаемым слоем, представляющую собой колонку, заполненную капроновым волокном с адсорбированными на нем клетками Pseudomonas fluorescens ВКПМ-6477, компрессором подают со скоростью 5000 ч^-1 газо-воздушную смесь, моделирующую производственные газо-воздушные выбросы с концентрацией стирола 100 мг/м³. На выходе из лабораторного реактора концентрацию стирола определяют методом газо-жидкостной хроматографии.

Эффективность очистки воздуха от стирола 95
П р и м е р 3. В лабораторный биореактор с орошаемым слоем с иммобилизованными на капроновом волокне клетками Pseudomonas fluorescens ВКПМ-6477 подают газо-воздушную смесь, содержащую стирол в концентрации 100 мг/м³ и этилбензол в концентрации 10 мг/м³.

Эффективность очистки газо-воздушной смеси при удельной производительности 5000 ч^-1 составляет по стиролу 85 по этилбензолу - 80

Использование: в биотехнологии и для разложения стирола и этилбензола. Сущность применения: новый штамм бактерий Pseudomonas fluorescens способен с высокой скоростью и эффективностью разлагать стирол и этилбензол.

Штамм бактерий Pseudomonas fluorescens ВКПМ-6477, разлагающий стирол и этилбензол.