ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS OLEOVORANS, РАЗЛАГАЮЩИЙ ОРГАНИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ Российский патент 1996 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 

Изобретение относится к биотехнологии, представляет собой новый штамм бактерий, способный с высокой интенсивностью разлагать органические соединения, и может быть использован для очистки сточных вод, воздуха, а также почв, загрязненных этими токсичными высокоустойчивыми соединениями.

Известно, что различные штаммы бактерий рода Pseudomonas способны разлагать органические соединения [1]
В качестве прототипа можно рассматривать штамм Psedomonas sp. ВКПМ В-3343, разлагающий нафталин и антрацен [2]
Задачей изобретения является получение нового штамма бактерий, способного разлагать высокие концентрации нафталина и антрацена, а также других органических соединений, а именно бензола, толуола, ксилолов, этилацетата, этанола, ацетальдегида, уксусной и салициловой кислот, меркаптанов.

Задача решается путем длительной адаптации штамма бактерии Pseudomonas sp. ВКПМ В-3343 к повышенным концентрациям органических соединений и последующих рассева и отбора наиболее активной культуры из отдельных колоний.

Полученный штамм определен как Pseudomonas oleovorans штамм Un (коллекционный номер ВKПМ В-6655) и имеет следующую характеристику.

Среды для хранения: МПА и минеральные среды с нафталином или тетрадеканом.

Морфологические признаки: подвижные палочки размером 0,8х1,5х0,5 мкм, грамотрицательные. При росте на МПА и минеральных средах образует светло-кремовые колонии с гладкой поверхностью.

Физиологические признаки: аэроб, температурный оптимум 25^оС, растет при +4^оС, не растет при 42^оС, оптимум pH 6,8-7,5.

Биохимические признаки: желатину не разжижает, нитраты восстанавливает до нитритов, молоко не изменяет, усваивает сахарозу, глюкозу, ксилозу, фруктозу, арабинозу, рамнозу с подкислением среды, при росте на мальтозе и лактозе среда не подкисляется, асиммилирует спирты: этанол, глицерин, маннит, алифатические углероды с длиной цепи от 8 до 20 атомов углерода, ароматические углероды: пирокатехин, бензол, толуол, м-ксилол, салицилат, дифенил, фенантрен.

Изобретение поясняется следующими примерами.

П р и м е р 1. Штамм Pseudomonas oleovorans ВКПМ В-6655 выращивают на питательной среде следующего состава, г/л: КН₂РО₄ 3,4; К₂НРО₄ 4,3; (NH₄)₂SO₄ 2,0; MgCl₂ 0,26; CaCl₂ 0,026; MnCl₂ · 4H₂O 0,001; FeSO₄ ·7H₂O 0,0006; Na₂MoO₄ ·2H₂O 0,002; нафталин 5; дистиллированная вода pH 7. Культивирование осуществляют в колбах при встряхивании на качалке (200 об/мин) при 28-30^оС. Через 3 сут в среде содержится нафталина 10% от исходного, полное потребление нафталина наблюдается на 4 сут.

3-Суточной суспензией выросшей культуры засевают питательную среду вышеуказанного состава, но содержащую в качестве источника углерода 1 г/л антрацена. Через 36 ч культивирования содержание антрацена составляет 0,1% от исходного. На 3 сут антрацен в среде не обнаружен.

Контроль за процессом разложения осуществляют с помощью метода газожидкостной хроматографии и масс-спектрометрии, для чего культуральную жидкость подкисляют 1 NHCl до pH 2,0, экстрагируют диэтиловым эфиром, растворитель упаивают на роторном испарителе, высушенный остаток растворяют в 0,3 мл пиридина и добавляют 0,1 мл силирующего агента (NO-бис(триметилсилил)трифторацетамид). Наличие метаболитов выявляют на газожидкостном хроматографе и идентифицируют методом масс-спектрометрии. Одним из наиболее характерных метаболитов, обнаруженных в эфирном экстракте, является гидроксинафтойная кислота, что может служить доказательством микробиологического разложения антрацена.

П р и м е р 2. В установку аэротенк-биофильтр, представляющую собой колонку, загруженную волокнами триацетилцеллюлозы с иммобилизованными в них в процессе формования клетками Pseudomonas oleovorans ВКПМ В-6655, и совмещенный с ней аэротенк, снизу перистальтическим насосом подают синтетический сток (раствор нафталина 40 мг/л в водопроводной воде).

Объем колонки 100 мл, скорость подачи жидкости 1 мл/с, аэрация 3,3 мл/с, pH 7,15, температура -20^оС. Установка эффективно работает весь испытательный срок, составляющий 60 сут; в выходящей воде содержание нафталина не превышает 10 мкг/л. Микробиологический контроль используемой культуры, произведенный на 50 сут работы установки, показал отсутствие заражения фильтрата посторонней микрофлорой.

П р и м е р 3. В установку, описанную в примере 1, перистальтическим насосом подают синтетический сток, состоящий, г/л: ацетон 0,1; этанол 0,2; бензол 0,1; уксусная кислота 0,1; салициловая кислота 0,1; аммонийные соли 2; нафталин 40 мг/л; антрацен 5 мг/л. Скорость подачи стока 0,5 мл/с, pH 7,0. Испытательный срок 30 сут.

В выходящей жидкости органические соединения не обнаружены.

П р и м е р 4. Через стеклянный биореактор с объемом рабочей зоны 15,7 см³, наполненный иммобилизованными на волокнистом синтетическом материале клетками Pseudomonas oleovorans ВКПМ В-6655 (плотность укладки 35 кг/м³, диаметр волокна 0,2 мм) пропускают воздух, содержащий 150 мг/м³ органического соединения. Биокатализатор увлажняют стерильным раствором двузамещенного фосфата аммония (2 г/л) в водопроводной воде. Эффективность очистки (средние значения, полученные в течение 40 сут работы биореактора) следующая, Бензол 80 ± 15 Толуол 80 ± 20 Ксилол 90 ± 10 Этилацетат 95 ± 5 Этанол 90 ± 10 Ацетальдегид 97 ± 3 Меркаптоэтанол 77 ± 10

Использование: для разложения органических соединений, в том числе нафталина, антрацена, салициловой кислоты, этанола, этилацетата, толуола, ксилолов, бензола, ацетальдегида, уксусной кислоты, меркаптанов, а также в биофильтрах для очистки сточных вод, почв и воздуха. Сущность изобретения: представляет собой новый штамм Pseudomonas oleovorans.

Штамм бактерий Pseudomonas oleovorans ВКПМ В-6655, разлагающий органические соединения.