ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS SPECIES, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ УТИЛИЗАЦИИ ФОРМАЛЬДЕГИДА И СПОСОБНЫЙ ПРИ ЭТОМ ПОТРЕБЛЯТЬ ФОРМАЛЬДЕГИД В КАЧЕСТВЕ ЕДИНСТВЕННОГО ИСТОЧНИКА УГЛЕРОДА И ЭНЕРГИИ В БЕДНОЙ МИНЕРАЛЬНОЙ СРЕДЕ Российский патент 1998 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 C12N1/20 C12R1/38 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма бактерий, используемых для биологической утилизации формальдегида, а также сопутствующих ему метанола и формиата в сточных водах химических производств (нефтехимзаводы, производства карбамидных смол, пластмасс и т.д.).

Появление в перерабатываемых сточных водах такого высоко-токсичного вещества, как формальдегид, подавляет дееспособность активного ила в биологических очистных сооружениях, которые являются важной частью крупных производств.

Одним из направлений создания высокоэффективных биологических очистных сооружений является использование специализированных штаммов бактерий - деструкторов формальдегида.

Известен штамм бактерий Pseudomonas fluorescens 27 [1] выделенный из активного ила и способный усваивать формальдегид, который получен в результате ступенчатого отбора по устойчивости к формальдегиду. Этих бактерий выращивают в аэробных условиях при температуре 25^oC на мясо-пептонном бульоне (МПБ), затем их переносят на минеральную среду с формальдегидом. Pseudomonas fluorescens 27 окисляют формальдегид в концентрации 250 мг/л за 72 ч, если в формальдегидсодержащую минеральную среду вносят 10% инокулята, выращенного на МПБ.

Недостатком данного штамма бактерий является способность к переработке формальдегида только при относительно низкой его концентрации в стоках, а именно не более 250 мг/л, также относительно невысокая скорость окисления формальдегида.

Известна также [2] смешанная микробная популяция, выделенная из активного ила и полученная адаптацией к присутствию формальдегида ступенчатым способом. Ее выращивают на искусственной минеральной среде, которая всегда содержит 100 мг/л глюкозы. Эта смешанная микробная популяция способна окислять формальдегид до муравьиной кислоты и даже до углекислого газа и частично ассимилировать его (формальдегид) в минеральной среде при 30^oC и pH на начало культивирования 7,5 в аэробных условиях в концентрации до 1000 мг/л; но для этого требуется добавлять в среду дополнительный источник углерода и энергии глюкозу в количестве, равном формальдегиду, 1000 мг/л. В таких условиях полное время окисления формальдегида до углекислого газа составляло 13 ч, а значение pH достигло 6,0.

Недостатком данной смешанной микробной популяции бактерий является способность к переработке формальдегида только в присутствии глюкозы, и при относительно низкой его концентрации не более 1000 мг/л, а также относительно невысокая скорость окисления формальдегида.

Наиболее близким к заявляемому штамму является штамм бактерий Pseudomonas fluorescens [3] (коллекция центрального музея промышленных микроорганизмов института ВНИИ генетики, коллекционный номер ЦМПМ N B-2079). Указанный штамм характеризуется следующими признаками: аэроб, температура культивирования 25-30^oC, оптимум pH 6,8-7,4, в минеральной среде способен окислять формальдегид при его исходной концентрации 500 мг/л за 3 часа.

Данный штамм бактерий не обеспечивает окисления формальдегида в сточных водах при его концентрации выше 500 мг/л. Ему свойственна относительно низкая скорость утилизации формальдегида.

Задачей изобретения является получение нового штамма бактерий, способного использовать формальдегид в составе бедных минеральных сред в качестве единственного источника углерода и энергии и обладающего высокими скоростями окисления формальдегида и устойчивостью к его абиотическому воздействию.

Предложенный нами не патогенный штамм метилотрофных бактерий аномально резистентен и более активен по отношению к формальдегиду и получен методами направленной автоселекции и скрининга из активного ила очистных сооружений Томского нефтехимического комбината (ТНХК). Бактерии полученного штамма способны использовать формальдегид в составе бедных минеральных сред в качестве единственного источника углерода и энергии в концентрации до 8000 мг/л. Бактерии выделенного штамма обнаруживают удельную скорость роста до 0,3 час^-1 при плотности до 3 г/л абсолютно сухой биомассы (АСБ) и способны выдерживать пиковые 15-минутные нагрузки по формальдегиду до 2000 мМ (64000 мг/л). При идентификации штамм этих бактерий был отнесен к роду Pseudomonas к группе флюоресцирующих видов и зарегистрирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером B-6798.

Заявляемый штамм Pseudomonas sp. N B-6798 характеризуется следующими признаками.

Морфологические и цитологические свойства
Штамм представляет собой грамотрицательные подвижные палочки разной длины до мелких овальных, почти кокковидных размером 0,7-1,2х1,0-2,9 мкм. Деление клеток осуществляется путем перетяжек. Данные электронной микроскопии свидетельствуют о наличии жгутиков длиной 5-7 мкм, расположенных пучком на одном полюсе в количестве от трех до семи, что вполне характерно для псевдомонад.

Культуральные и физиолого-биохимические свойства
При росте на мясо-пептонном агаре (МПА) колонии изучаемых бактерий достигают 4 мм в диаметре, бежевого цвета, прозрачные, профиль кратерообразный, поверхность с маслянистым блеском, слегка шагреневая. На бедном агаре с формальдегидом 250 мМ, как единственном источником углерода и энергии, на третьи сутки колонии вырастают до 1 мм в диаметре, бледно-бежевого цвета, матовые, приподнятые над поверхностью среды, плоские.

На МПА при температуре +7^oC бактерии описываемого штамма образуют внеклеточный желто-зеленый пигмент, а при комнатной температуре синтезируют с возрастом дополнительный пигмент буровато-желтый. Образуемый культурой пигмент является антибиотиком, подавляющим рост некоторых грамположительных бактерий родококков. Образуется пигмент и в жидкой среде (МПБ) при глубинном периодическом культивировании в колбах на качалке бактерии растут диффузно, создавая равномерную муть по всему объему жидкой среды, способны расти на бедных минеральных средах с формальдегидом в концентрациях до 8000 мг/л (в последнем случае к концу 3-их сут на дно выпадает хлопьевидный осадок, представляющий собой крупные конгломераты бактерий, предположительно склеенных слизью).

Установлено, что заявляемый штамм бактерий обладает слабыми галлофильными свойствами. Аэроб. Не является олигонитрофилом. Денитрифицирует. Активно аммонифицирует белки с образованием аммиака. Температурный оптимум роста +30^oC. Определены пределы роста: +5 +39^oC. Оптимум pH 6,0-7,5. Необходимость внесения витаминов в среду отсутствует. Способен к образованию экзополисахаридов. На глицерине растет хорошо, длинных нитевидных клеток не образует, крахмал не гидролизует, желатину не разжижает, индол и сероводород не образует, каталазоположителен.

Непрерывное культивирование
Проведенная серия экспериментов по непрерывному культивированию (моделирующих работу очистных сооружений по утилизации формальдегидсодержащих стоков ТНХК) описываемых псевдомонад на бедной минеральной среде М-9 с формальдегидом в качестве единственного источника углерода и энергии показала, что процесс культивирования может быть устойчивым лишь при регуляции протока, например, в режиме pH-стата. При этом максимальная удельная скорость роста заявляемых бактерий отмечена на уровне 0,3 ч^-1, что при концентрации биомассы в ферментере 3,0 3,5 г АСБ/л соответствует скорости усвоения формальдегида 2,7 мМ (85 мг) в минуту на 1 г АСБ.

Предлагаемый штамм бактерий Pseudomonas sp. N-B 6798 превышает способности штамма-прототипа по предельно-допустимой концентрации формальдегида в среде и по скорости его окисления не менее чем в 15 раз.

Источники информации
1. Леонова В.Е. и др. Действие формальдегида на штамм Pseudomonas fluorescens. Микробиология, 1977, Вып. 4, с. 750-754.

2. Патент ГДР N 217199, кл. 3 C 02 F 3/02, опубл. 9.01.85.

3. Штамм B-2079 Pseudomonas fluorescens (N 1621/27-6). Каталог культур микроорганизмов. М. 1982, с.256 (прототип).

Использование: микробиологическая промышленность, в частности, для биологической утилизации формальдегида, а также сопутствующих ему метанола и формиата. Сущность изобретения: из активного ила очистных сооружений получен новый штамм Pseudomonas species методами направленной автоселекции и скрининга. Штамм способен использовать в качестве единственного источника углерода и энергии формальдегид в концентрации до 8000 мг/л.

Штамм бактерий Pseudomonas species ВКПМ В-6798, используемый для утилизации формальдегида и способный при этом потреблять формальдегид в качестве единственного источника углерода и энергии в бедной минеральной среде.