ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS CEPACIA ВДК ВКПМ В-7559 - ДЕСТРУКТОР ФЕНОЛА И ФОРМАЛЬДЕГИДА Российский патент 2000 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 C12N1/20 C12R1/38 

Изобретение относится к промышленной микробиологии и касается получения нового штамма-деструктора, способного в качестве питательного субстрата использовать одновременно и фенол и формальдегид с исходной концентрации не менее 400-500 мкг/мл, соответственно.

Фенол и формальдегид - токсические соединения, получаются в результате разложении карбамидоформальдегидной смолы (КФС), карбамидного клея в отходах мебельных предприятий при изготовлении и отделке древесных плит. При этом токсиканты попадают в сточные воды и в атмосферу.

Штамм может быть использован в биореакторах для микробиологической очистки сточных вод, содержащих высокие концентрации фенола и формальдегида.

Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов и ему присвоен номер ВКПМ В-7559 (Москва, ГНИИ генетика - ВКПМ).

Для эффективной микробиологической детоксикации стоков, содержащих токсиканты, относящиеся к различным по структуре соединениям, необходимы микроорганизмы-деструкторы с широким спектром субстратной специфичности.

В нашей стране и за рубежом ведутся работы по созданию микроорганизмов, которые приобретают деструктивные свойства по отношению к нескольким токсическим соединениям. Например, Якимов с соавт. предложил штамм бактерий Pseudomonas fluorescens, разлагающий стирол и этилбензол (а. с. СССР N 1375647, кл. C 12 N 1/20, 1988) и штамм бактерий Methylobacterium species, разлагающий метанол и/или формальдегид (а. с. СССР N 1017730, кл. C 12 N 1/20, 1982). Однако попытки получения штаммов-деструкторов, способных утилизировать одновременно фенол и метанол или формальдегид, которые относятся к различным по химической структуре токсикантам, оказались безуспешными (Березкина Н.Е., Григорьева С.П., Андреевская Е.А., Рудченко О.Н., Душников А. А. Выделение комплексов бактерий-деструкторов фенола и метанола // Прикладная биохимия и микробиология. - 1992. - Т.28. Вып. 4. - С. 565-570). В лучшем случае предлагается для этой цели консорциум штаммов, например, "Консорциум штаммов бактерий Bacilus megaterium, Bacilus freudereichii, Agrobacterium ... (RU 2037472 C1,1995, C 02 F 3/34).

Целью изобретения является получение штамма из микроорганизмов рода псевдомонас, способного одновременно использовать в качестве питательного субстрата фенол и формальдегид в достаточно высоких концентрациях.

Для выявления и выделения клонов микроорганизмов, способных в качестве источника углерода и энергии использовать несколько различных по химической природе токсикантов, был использован предложенный нами способ, где проверяемые микроорганизмы, заключенные в минимальную питательную среду при способности использовать токсиканты в качестве питательного субстрата, формируют бактериальный рост вокруг носителей конкретных токсикантов, которыми пропитаны бумажные диски, накладываемые на поверхность минимальной среды с искомыми микроорганизмами.

При проверке штаммов бактерий, относящихся к непатогенным видам рода Pseudomonas (коллекция микроорганизмов ВолгНИПЧИ), был обнаружен штамм P. cepacia 4176, который был способен использовать в качестве единственного источника углерода и энергии фенол и формальдегид. Выявленный штамм с полисубстратной специфичностью обладал типичными культуральными и биохимическими свойствами и был способен утилизировать фенол и формальдегид с исходных концентраций 80 и 100 мкг/мл, соответственно. Этот штамм при росте на МПГА формировал плотные колонии телесного цвета, в бульоне образовывал пленку. При электронной микроскопии взвеси бактерий этого штамма методом негативного контрастирования отмечено большое количество капсулоподобного материала вокруг клеточных скоплений и единичных клеток. На препаратах ультратонких срезов выявляется повышенная вакуолизация внутриклеточного содержимого бактерий, что, по-видимому, связано с происходящей перестройкой метаболической активности и, возможно, с активацией синтеза ферментов деструкции токсикантов. При изучении внехромосомного нуклеинового материала у P. cepacia ВДК бьша выявлена криптическая плазмида.

С помощью селекции на градиентных чашках, содержащих возрастающие концентрации фенола и формальдегида, из популяции выявленной культуры P. cepacia 4176 был получен клон, получивший в дальнейшем название P. cepacia ВДК, способный деградировать смесь фенола и формальдегида с исходной концентрацией 400 и 500 мкг/мл, соответственно.

Культура Pseudomonas cepacia ВДК была принята на национальное патентное депонирование 17 марта 1988 года. Принятая культура получила во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов коллекционный соответственно номер: ВКПМ В-7559.

Характеристика штамма Pseudomonas cepacia ВДК ВКПМ В-7559. Среда для хранения: МПА и минеральная среда, содержащая по 0,01 фенола и метанола.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки грамотрицательные, неспорообразующие подвижные палочки размером 0,4 х 1,2 мкм. Рост на МПБ с образованием пленки. На МПА колонии на 2 сут роста до 3-5 мм в диаметре, гладкие, кремовые, в дальнейшем могут ослизняться.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб, растет при 24-32^oC, оптимальное значение pH среды 6,8-7,3. Обладает оксидазной, твинэстеразной и липазной активностью. Восстанавливает нитраты в нитриты, не гидролизует крахмал, желатину. Усваивает глюкозу, арабинозу, маннозу, мальтозу, салицил, салициловую и бензойную кислоты, глицерин. При выращивании на минеральной среде с фенолом и метанолом использует их в качестве единственных источников углерода и энергии.

При внутрибрюшинном введении по 0,5 мл суточной миллиардной суспензии P. cepacia ВКПМ ВДК В-7559 белым беспородным мышам и морским свинкам животные не падали в течение 30 суток (срок наблюдения). В конце опыта животных усыпили хлороформом, вскрыли и произвели посевы внутренних органов на МПА отпечатками с целью выявления бактериального заражения. Чашки с посевами культивировали при 37^oC в течение 6 сут, рост микроорганизмов не обнаружен.

Промышленная применимость штамма подтверждается следующими примерами.

Пример 1.

Испытание утилизирующей активности штамма Р. cepacia ВДК ВКПМ В-7559. Утилизирующую активность испытывали при культивировании в колбах на шейкере (180 об/мин) при температуре 20-24^oC. Культуру штамма P. cepacia ВДК ВКПМ В-7559 в концентрации 10⁷ м.к. на 1 мл добавляли к смеси раствора фенола (400 мг/мл) и формальдегида (500 мг/мл). В качестве биогенных добавок использовали глицерин до 0,2% в конечной концентрации и фосфорную кислоту (25-30 мкл на 100 мл субстратной смеси). Через 3 сут концентрация токсикантов в смеси составила менее 1%.

Пример 2. Контроль деструктирующей активности штамма Р. cepacia ВДК ВКПМ В-7559 путем проверки на токсичность культуральной среды после проведенной деструкции токсикантов. Токсичность культуральной среды определяли методом биотестирования с помощью стандартного промышленно изготавливаемого комплекта токсихромотест (Канада, ЕВРI) по методике, описанной Жмур Н.С. (Государственный и производственный контроль токсичности вод методами биотестирования в России. М: Международный Дом Сотрудничества, 1997.-117 с.)
Бактериальные клетки удаляли центрифугированием при 7000 об/мин в течение 15 мин при комнатной температуре. Контроль на токсичность показал отсутствие острой токсичности не разбавленной культуральной среды.

Таким образом, представленный штамм P. cepacia ВДК ВКПМ В-7559 способен использовать в качестве питательного субстрата одновременно фенол и формальдегид в больших концентрациях, не обладает патогенными свойствами по отношению к экспериментальным животным (белым мышам, морским свинкам), что позволяет использовать его в качестве деструктора этих токсических веществ на очистных сооружениях. Этот штамм можно использовать для микробиологической очистки промышленных и бытовых стоков, содержащих фенол и формальдегид в достаточно высоких концентрациях.

Изобретение относится к промышленной микробиологии. Целью изобретения является получение штамма из микроорганизмов рода псевдомонас, способного одновременно использовать в качестве питательного субстрата фенол и формальдегид в достаточно высоких концентрациях. Новый штамм Pseudomonas cepacia ВДК способен использовать в качестве питательного субстрата одновременно фенол и формальдегид. Это позволяет использовать его в качестве деструктора этих токсических веществ на очистных сооружениях. Штамм рекомендуется использовать для микробиологической очистки промышленных и бытовых стоков. Он не токсичен, не вызывает ухудшения экологических систем.

Штамм бактерий Psendomonas cepacia ВДК ВКПМ В-7559, деструктор токсических вещество - фенола и формальдегида.