СРЕДСТВО ДЛЯ ДЕСТРУКЦИИ СТИРОЛА Российский патент 2010 года по МПК C12N1/26 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для очистки многокомпонентных парогазовых смесей от вредных примесей, в частности для очистки от стирола.

Известен (RU патент 2073713) штамм бактерий Pseudomonas caryophylli 102/1 (коллекция МЖК института "Микроб" г.Саратова КМ 92) - деструктор стирола.

Также известен (RU патент 2967115) штамм бактерий Pseudomonas fluorescens ВКПМ-6477, разлагающий стирол и этилбензол.

Известен также (RU патент 2109051) штамм бактерий Pseudomonas fluorescens KM 93=101/2, разлагающий ацетон, уайт-спирит, стирол и ксилол.

Недостатком указанных штаммов следует признать их недостаточную эффективность.

Наиболее близким аналогом разработанного штамма можно признать Paracoccus alcaliphilus штамм DSM-8512, описанный Ураками с соавторами (Urakami Т., Tamaoka J., Suzuki K.-I., Komagata К., Paracoccus alcaliphilus sp.nov., an alkaliphilic and facultatively methylotrophic bacterium. Int. J. Syst. Bacteriol., vol.39, 1989, pp.116-121).

Техническая задача, решаемая посредством использования разработанного штамма, состоит в обеспечении эффективной возможности удаления паров стирола из газовоздушных смесей, в частности вентиляционных выбросов промышленных предприятий.

Технический результат, получаемый при промышленном использовании разработанного штамма, состоит в улучшении экологической обстановки в зоне промышленных предприятий.

Указанный технический результат осуществим при использовании разработанного штамма Paracoccus alcaliphilus Sty2-VH (коллекция производственных штаммов микроорганизмов лаборатории инженерной энзимологии Института биохимии им. А.Н.Баха РАН) - деструктора стирола.

(Специфическая нуклеотидная последовательность из 16S-рибосомной РНК зарегистрирована 21.04.2006 в Международном Генетическом банке (GenBank) под номером DQ469585).

Штамм выделен путем направленной селекции из естественного источника без применения искусственных мутагенов и методов генной инженерии.

Источником для выделения указанного штамма послужили образцы почвы, взятые в районе нефтяных скважин сухопутного месторождения Локбатан (Карадагский район, Азербайджан).

В качестве среды для выделения и культивирования использовали минимальную минеральную среду состава (в г на 1 л дистиллированной воды): (NH₄)₂SO₄ - 2,0; K₂HPO₄ (б/в) - 4,3; NaH₂PO₄ (б/в) - 3,2; MgSO₄ - 0,12; CaCl₂ - 0,04; MnCl₂ - 0,02; CuSO₄ - 0,005; Н₃ВО₃ - 0,004; ZnSO₄ - 0,01; FeSO₄ - 0,03. Значение рН среды устанавливали на уровне от 7,2 до 7,4 путем добавления 10% раствора НСl или КОН, соответственно. Для получения твердых сред применяли агар-агар в конечной концентрации 1,5-2%. Стерилизацию готовой среды проводили нагреванием при избыточном давлении 0,5 атм в течение 40 мин. Источником органического углерода служат пары стирола или этилбензола.

Первоначальные накопительные культуры получали путем помещения исходного материала (образцы почвы, взятые в районе нефтяных скважин сухопутного месторождения Локбатан (Карадагский район, Азербайджан)) в стеклянные цилиндры объемом 500 мл с 75-100 мл описанной выше нестерильной минимальной минеральной среды или в стеклянные мини-реакторы с полимерным наполнителем, орошаемым циркулярно-капельным методом минимальной минеральной средой. Поток воздуха с парами соответствующего органического субстрата или их смеси пропускали либо методом барботирования через жидкую среду (при применении цилиндров), либо непосредственно через слой увлажняемого полимерного наполнителя (при использовании мини-реакторов). При наличии заметного роста бактерий среду несколько раз (не менее 5) частично заменяли на свежую. Культивирование проводили до появления четко регистрируемого методом газовой хроматографии снижения концентрации паров соответствующих летучих органических соединений в потоке воздуха на выходе из аппарата, применяемого для накопительного культивирования. Температура накопительного культивирования - комнатная (18-20°С).

Выделение чистых культур и штаммов проводили традиционными микробиологическими методами, используя культивирование в чашках Петри на поверхности агаризованной минеральной среды минимального состава в парах соответствующих целевых органических субстратов. Выделенные штаммы сохраняли в пробирках со скошенными столбиками агаризованной минимальной минеральной среды, используя посев уколом в основание столбика с последующим распределением посевного материала по его скошенной поверхности. Выращивание культур при этом проводили также в парах соответствующего целевого органического субстрата.

Во всех случаях использовали либо термостаты с температурой 28°С, либо термостатированную комнату (27-28°С).

Характеристики выделенного штамма Paracoccus alcaliphilus Sty2-VH - деструктора стирола.

Проверку чистоты выделенных штаммов проводили микроскопированием живых препаратов (с применением фазового контраста, объектив 40^Х), фиксированных и окрашенных карболовым фуксином или генцианвиолетом препаратов (с иммерсией, объектив 100^Х), а также высевом на богатые агаризованные среды.

Предварительное таксономическое определение проведено по результатам изучения основных морфологических и биохимических характеристик. По этим признакам штамм отнесен к виду Paracoccus alcaliphilus, приведенному в определителе бактерий Берджи со ссылкой на описание Россо с соавторами (Rossau et.al., Int. J. Syst. Bacteriol., vol.37, 1987, pp.1989-210), с некоторыми нетипичными признаками, более характерными для близкого к нему вида Paracoccus denitrificans (рост при более низких значениях рН, ферментация трегалозы, отсутствие потребности в биотине).

Окончательное определение до вида проведено с учетом данных молекулярно-генетического анализа характерных нуклеотидных последовательностей консервативных участков 16S-PHK (код по IEGB: DQ469585.1 GI:93484001). Наиболее близким по этому показателю описанным видом является Paracoccus alcaliphilus штамм DSM-8512, описанный Ураками с соавторами (Urakami Т., Tamaoka J., Suzuki K.-I., Komagata К., Paracoccus alcaliphilus sp.nov., an alkaliphilic and facultatively methylotrophic bacterium. Int. J. Syst. Bacteriol., vol.39, 1989, pp.116-121).

Ни у одного из описанных штаммов Paracoccus alcaliphilus или Paracoccus denitrificans в приводимых для них описаниях нет упоминания об окислении производных ароматических углеводородов типа стирола, этилбензола или иных органических субстратов сходной структуры.

Описание штамма Paracoccus alcaliphilus штамм Sty2-VH

Мелкие кокковидные палочки 0,5-0,7×0,8-1,0 мкм. Цепочек, как правило, не образуют. При росте на жидких и твердых минеральных средах в присутствии паров стирола или этилбензола чаще всего представлены одиночными клетками, значительно реже, главным образом в молодых активно растущих культурах, встречаются парные клетки или короткие, быстро распадающиеся цепочки из двух-трех клеток. Капсул и чехлов не образуют. Грамотрицательные. Неподвижны на всех стадиях развития культуры.

При росте на агаризованной минеральной среде в парах стирола образуются мелкие, округлые, диаметром 1-2 мм, гладкие, выпуклые, с ровными краями, белые непрозрачные колонии сметанообразой консистенции, постепенно приобретающие (на 7-8 сутки роста) слегка светло-кремовый оттенок. При росте на агаризованной минеральной среде с глюкозой (1%) и пептоном (0,25%) образуются средние, округлые, диаметром 4-6 мм, гладкие, выпуклые, с ровными краями, светло-кремовые непрозрачные колонии сметанообразной консистенции, которые со временем накапливают желтый пигмент.

Аэроб, имеет метаболизм чисто дыхательного типа с использованием кислорода в качестве конечного акцептора электронов. В органических факторах роста не нуждается. Имеет хемоорганотрофный тип метаболизма. Каталаза и оксидаза присутствуют.

Диапазон пригодных для роста значений рН - от 5,5 до 9,5.

Наиболее оптимальный для роста диапазон значений рН - 7,2-7,6.

Диапазон пригодных для проявления специфической субстратной активности температур - от 9°С до 35°С.

Оптимальный для роста диапазон температур - 28-30°С.

Полностью разлагает стирол, этилбензол, фенилуксусный альдегид, виниловый спирт, метанол. Ферментирует глюкозу, фруктозу, D-ксилозу, трегалозу, L-аргинин, L-валин. В качестве источника азота может использовать нитрат. Расщепляет катехол по орто-пути. Способен накапливать поли-β-гидроксибутират.

Целевой субстрат: стирол в концентрациях до 1000-1250 мг/м³; этилбензол в концентрациях до 850-900 мг/м³, восстановление конверсии паров целевых субстратов после выделения и лабораторного культивирования чистого штамма - полное.

Указанный штамм был выделен в чистую культуру и охарактеризован с целью его применения в устройствах микробиологической очистки воздуха и промышленных вентиляционных выбросов от паров стирола, этилбензола и сходных с ними органических субстратов в качестве живого компонента соответствующих биокатализаторов.

Активную культуру сохраняют на пластинках (чашки Петри) и косяках (микробиологические пробирки) агаризованной базовой минеральной среды после предварительного выращивания в парах целевого субстрата.

Для длительного хранения используют замораживание и хранение суспензий клеток в базовой минеральной среде с 5% (объем/объем) сыворотки крупного рогатого скота (СКРС) при температуре -70°С или лиофилизацию суспензий клеток стандартными методами в забуференном фосфатами физрастворе (0,75% NaCl в 0,1 N K-Na-фосфатном буфере с рН=7,2), содержащем 10% (объем/объем) СКРС и 0,05% (вес/объем) Na₂SO₃. Лиофилизованные препараты хранят расфасованными в герметичные упаковки при температуре -18°С.

Штамм непатогенный, безопасен для здоровья человека и животных, обеспечивает быструю и полную деструкцию паров стирола и этилбензола, обладает высокой генетической стабильностью, хорошей адаптивностью и стойкостью к условиям работы в микробиологических воздушных фильтрах, высокой устойчивостью к посторонней микрофлоре, а также практически полным отсутствием образования вредных и пахучих вторичных метаболитов; имеет минимальные потребности к составу питательной среды, хорошо переносит высушивание и другие виды консервации, быстро и полно восстанавливает после этого свои рабочие свойства.

Примеры специфической субстратной активности

Пример 1

Проверялась способность выделяемого штамма обеспечивать удаление из воздуха паров стирола на стадии первичной накопительной культуры.

В эксперименте использовали стеклянный лабораторный мини-реактор, заполненный полимерной насадкой, покрытой слоем растущих микроорганизмов (биопленкой) и орошаемой циркулярно-капельным методом минимальной минеральной средой описанного выше состава (в г на 1 л дистиллированной воды): (NH₄)₂SO₄ - 2,0; K₂HPO₄ (б/в) - 4,3; NaH₂PO₄ (б/в) - 3,2; MgSO₄ - 0,12; CaCl₂ - 0,04; MnCl₂ - 0,02; CuSO₄ - 0,005; Н₃ВО₃ - 0,004; ZnSO₄ - 0,01; FeSO₄ - 0,03; значение рН среды от 7,2 до 7,4.

В качестве очищаемой газовоздушной смеси использовали нагнетаемый компрессором комнатный воздух, к которому с помощью специального дозирующего устройства подмешивали пары стирола в нужной концентрации. Смесь подавали в мини-реактор со скоростью порядка 600-660 мл/ч на 1 мл объема насадки (от 200 до 220 мл/мин), контролируя ее лабораторным ротаметром.

Контроль концентрации паров стирола в исследуемой газовоздушной смеси осуществляли с использованием стандартного газохроматографического анализа проб объемом от 100 до 500 мкл в газовом хроматографе ЛХМ-2000 (завод "Хроматограф", г.Москва) с пламенно-ионизационным детектором (ПИД). Условия анализа: стеклянная колонка длиной 200 см, диаметром 3 мм, заполненная нейтральным носителем (Chromaton N-AW-DWCS, пропитанный 5% силикона SE-30, фирмы Chemapol, Чехия) с диаметром частиц 120-150 мкм; температура испарителя 150°С; температура детектора (ПИД) 220°С; газ-носитель азот или аргон хроматографической чистоты со скоростью протока 15 мл/мин; скорость протока водорода и сжатого воздуха для ПИД - 20 мл/мин и 150 мл/мин, соответственно. Пробы на входе и на выходе мини-реактора отбирали через силиконовые клапаны с использованием шприцев для газовой хроматографии (Gastight или Hamilton) объемом 100 или 500 мкл. Концентрацию стирола рассчитывали интегрированием нормализованной площади под кривыми его выходных пиков по калибровочной кривой, заранее построенной с использованием стандартных разведении смеси воздуха с парами стирола в точно известной концентрации. Построение диаграмм и расчет интегрированной площади под кривыми пиков выхода стирола проводили с использованием компьютерной программы "Z-lab, v.2.6.40", поставляемой службой технической поддержки завода "Хроматограф" совместно с фирмой ЗАО НТФ"Бинар".

Пример 2

Проверяли способность выделенного штамма Paracoccus alcaliphilus штамм Sty2-VH обеспечивать удаление из воздуха паров стирола на стадии чистой, поддерживаемой в лабораторных условиях культуры.

В эксперименте использовали стеклянный лабораторный мини-реактор, заполненный полимерной насадкой, покрытой слоем культуры Paracoccus alcaliphilus штамм Sty2-VH (биопленкой) и орошаемой циркулярно-капельным методом минимальной минеральной средой состава (в г на 1 л дистиллированной воды): (NH₄)₂SO₄ - 0,1; K₂HPO₄ (б/в) - 0,8; NaH₂PO₄ (б/в) - 0,5; MgSO₄ - 0,04; CaCl₂ - 0,04; MnCl₂ - 0,02; CuSO₄ - 0,005; Н₃ВО₃ - 0,004; ZnSO₄ - 0,01; FeSO₄ - 0,03; значение рН среды от 7,4 до 7,6.

В качестве очищаемой газовоздушной смеси использовали нагнетаемый компрессором комнатный воздух, к которому с использованием дозирующего устройства подмешивали пары стирола в нужной концентрации. Смесь подавали в мини-реактор со скоростью порядка 900-960 мл/ч на 1 мл объема насадки (от 300 до 320 мл/мин), контролируя ее лабораторным ротаметром.

Контроль концентрации паров стирола в исследуемой газовоздушной смеси осуществляли с помощью стандартного газохроматографического анализа согласно описанию, приведенному в Примере 1. Пары стирола полностью удалены.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для очистки многокомпонентных парогазовых смесей от стирола. Средство для деструкции стирола представляет собой штамм Paracoccus alcaliphilus Sty2-VH, депонированый в коллекции производственных штаммов микроорганизмов лаборатории инженерной энзимологии Института биохимии им. А.Н.Баха РАН. Изобретение позволяет повысить эффективность удаления паров стирола из газовоздушных смесей.

Средство для деструкции стирола, представляющее собой штамм Paracoccus alcaliphilus Sty2-VH.