ШТАММ STREPTOMYCES OLIVOCINEREUS - ПРОДУЦЕНТ ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗЫ Российский патент 1995 года по МПК C12N9/92 C12N9/92 C12R1/465 

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый штамм микроорганизмов - продуцент фермента глюкозоизомеразы, который может найти применение в пищевой промышленности для получения глюкозофруктозного сиропа и фруктозы - заменителя сахара, а также для увеличения подслащивающей способности глюкозусодержащих паток в крахмалопаточной промышленности.

Известны различные штаммы микроорганизмов - продуцентов глюкозоизомеразы, относящиеся в основном к стрептомицетам и молочнокислым бактериям. Штаммы проявляют различную способность к образованию глюкозоизомеразы, растут преимущественно на дорогих, содержащих пищевое сырье средах [1].

В качестве прототипа можно рассматривать штамм Streptomyces olivocinereus 154 (по старой классификации Actinomyces olivocinereus) - продуцент глюкозоизомеразы [2] . Штамм был выделен из почв Таджикистана, растет на питательной среде, содержащей ксилозу, глюкозу, пептон и гидролизат казеина. Известный штамм продуцирует глюкозоизомеразу, превращающую 45% глюкозы во фруктозу за 20 ч. Штамм хранится в коллекции культур Института биохимии им. А.Н.Баха РАН.

Цель изобретения - получение нового штамма Streptomyces olivocinereus, проявляющего более высокую, чем известный глюкозоизомеразную активность.

Новый штамм Streptomyces olivocinereus ВКПМ S-1169 получен путем рассева культуры Streptomyces olivocinereus 154 и отбора наиболее активных колоний.

Штамм имеет следующую характеристику.

Морфологические признаки: cпороносцы спиральные, споры имеют гладкую оболочку.

Среда Чапека. Воздушный мицелий серо-белый. Субстратный мицелий буровато-коричневый. В среду выделяется коричневый пигмент. На среде Гаузе воздушный мицелий отсутствует. В среду выделяется коричневый пигмент.

На мясопептонном агаре воздушный мицелий отсутствует. В среду выделяется светло-коричневый пигмент. При росте на среде с глицерином и аспарагином воздушного мицелия нет. В среду выделяется коричневатый пигмент.

Физиологические признаки. Культура растет при 24-38^оС. Оптимальная температура 28-30^оС. Оптимум рН - 6,8-7,1. Использует в качестве единственных источников углерода: ксилозу, рамнозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, рафинозу, глюкозу, инозит, маннит, L-арабинозу. Фермент образует только в присутствии ксилозы. Культура разжижает желатину, пептонизирует молоко. Глюкозоизомераза из клеток нового штамма Streptomyces olivocinereus была получена в лабораторных и полупроизводственных условиях.

П р и м е р. Посевной материал выращивают в течение 5 с на модифицированной среде Чапека с глюкозой, ксилозой и с добавлением ионов кобальта следующего состава, г/л: KH₂PO₄ 0,5, MgSO₄ ˙7H₂O 0,5, NaCl; 0,5, KNO₃ 0,5, FeSO₄ следы, ксилоза 5,0, глюкоза 5,0, СoCl₂ ˙6H₂O 10^-3 М.

С агаризованной среды Чапека выросший мицелий переносят на жидкую питательную среду следующего состава, г/л: ксилоза 5-7; глюкоза 3-5; пептон 8-10; кукурузный экстракт 20; MgSO₄ ˙7H₂O 0,3-0,6; NaCl 3-6; CoCl₂ ˙6H₂O 0,1-0,2 (pH = 6,8-7,0).

Выращивание проводят при 28-30^оС в течение 3 с. Посевной материал, полученный на этой среде, вносят в питательную среду того же состава. Максимальное накопление биомассы и глюкозоизомеразы происходит при культивировании в колбах Эрленмейера в течение 24 ч; при культивировании в японских ферментерах (фирма Marubishi) ферментация заканчивается через 14-17 ч. После отделения биомассы центрифугированием и отмывки от остатков питательной среды фосфатным буфером (0,005 М) мицелий высушивают при комнатной температуре. Экстракцию фермента осуществляют фосфатным буфером или дистиллированной водой. Экстракт может быть лиофилизирован с сохранением активности. Ферментный препарат глюкозоизомеразы может быть получен из экстракта осаждением ацетоном или сернокислым аммонием. Сухие клетки также могут служить источником фермента. Фермент, находящийся в клетках, катализирует процесс изомеризации глюкозы во фруктозу при 60-80^оС. Максимальный выход фруктозы при изомеризации 0,5 М глюкозы клетками продуцента - 10,2%/ч, средний выход - 7,0%/ч. Фруктозу определяют по методу Першерона.

Продуктивность штамма Streptomyces olivocinereus - продуцента глюкозоизомеразы составляет 444 μ М/мин на 1 л питательной среды. Активность внутриклеточной глюкозоизомеразы - 74 Гл ИА ед/г а.с.в.

Определение активности внутриклеточной глюкозоизомеразы проводят на основании результатов изучения свойств данного фермента. рН - оптимум действия глюкозоизомеразы S. olivocinereus находится при рН 8,5. Оптимум температуры действия - при 80^оС. Реакционная смесь состояла (на 1 мл) из раствора глюкозы 0,5 М в 0,2 М K, Na фосфатном буфере, рН - 8,5, t - 60^oC с добавлением 3,5 мг MgSO₄ ˙7H₂O и 0,25 мг CoCl₂ ˙6H₂O. Активность определяем не при оптимуме температуры, так как при 80^оС происходит более быстрая инактивация фермента, чем при 60^оС. Величина активности, определенная при 60^оС составляет примерно половину активности, определенной при 80^оС.

Таким образом, получен новый штамм с высокой активностью глюкозоизомеразы.

Использование: биотехнология, представляет собой новый штамм Streptomyces olivocinereus ВКПМ S-1169 - продуцент глюкозоизомеразы. Сущность изобретения: при использовании клеток продуцента для изомеризации глюкозы во фруктозу выход фруктозы составляет до 10,2% в час. Продуктивность штамма S. olivocinereus ВКПМ S-1169 составляет 444 mМ/мин на 1 л питательной среды. Активность внутриклеточной глюкозоизомеразы - 74 Гл ИА ед/г а.с.в., определенная при 60°С.

ШТАММ STREPTOMYCES OLIVOCINEREUS - ПРОДУЦЕНТ ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗЫ.

Штамм Streptomyces olivocinereus ВКПМ S-1169 - продуцент глюкозоизомеразы.