Белковый противоопухолевый антибиотик, названный кедарцидин, описан в патенте США N 5 001 112. Этот антибиотик является комплексом изолированной цепочки полипептида и небелкового хромофора. Антибиотик кедарцидин получают путем ферментации штамма Streptoalloteichus sp. nov L 585-6 (АТСС-53650), а изолирование и очистка кедарцидина описаны в примере 4 ранее упомянутого патента США. Ссылка на патент не только не описывает и не предполагает никакой процедуры для отделения хромофора от изолированного кедарцидинового антибиотика, но и не предполагает, что противоопухолевая активность кедарцидина остается в небелковом хромофоре.
Противоопухолевый антибиотик, названный "неокарциностатин", состоит из комплекса в соотношении 1:1 из белка и небелкового хромофора. В литературе описано, что хромофорная часть неокарциностатина может быть отделена от комплекса неокарционостатина путем экстракции с помощью кислого метанола и что противоопухолевые свойства неокарциностатина остаются главным образом в хромофоре. В случае с неокарциностатином была определена структура хромофора (см. пример, I.Antibiotics, 1989, 42, 761-768). В случае с кедарцидином, тем не менее, процедуры экстракции метанолом было недостаточно для получения очищенного хромофора.
Другой белковый противоопухолевый антибиотик, обозначенный ауреомидин, также содержит белковый компонент и небелковый хромофор. Хромофор данного антибиотика также был выделен из антибиотика путем экстракции метанолом (см. Biochem Biophys. Res. Commun 1980, 94, 255-261), а противоопухолевая активность была вновь обнаружена первоначально в хромофоре.
Известны и другие белковые противоопухолевые антибиотики, содержащие небелковый хромофор, в которых хромофор не может быть успешно выделен из антибиотика как при помощи процедуры экстракции метанолом, описанной выше, так и с помощью других соответствующих процедур очистки. Обычно хромофоры подобных белковых антибиотиков, даже если они могут быть выделены и изолированы, являются более нестабильными, нежели комплекс антибиотика сам по себе.
Изобретение относится к новому противоопухолевому хромофору, полученному из кедарцидинового антибиотика.
Изобретение касается также способа получения хромофора кедарцидина, который включает операции (а) получения водного раствора кедарцидина;
(b) проведения в указанном растворе органической экстракции с помощью этилацетата;
(c) сбора экстракта этилацетата;
(d) проведения колоночной хромотографии на силикагале указанного этилацетатного экстракта с использованием бензол-метанолового ступенчатого градиентного элюента; и
(e) сбора фракции, содержащей хромофор кедарцидина.
Другим аспектом изобретения является способ торможения развития опухоли в организме млекопитающего-хозяина, включающий введение в организм-хозяин количества хромофора кедарцидина, тормозящего рост опухоли, или фармацевтический состав указанного препарата.
Изобретение относится также к фармацевтическому составу (веществу), содержащему количество кедарцидина, тормозящее рост опухоли, а также фармацевтически приемлемый носитель разбавителя.
На фиг. 1 показан инфракрасный абсорбционный спектр хромофора кедарцидина (KBr-таблетка).
На фиг. 2 показан ультрафиолетовый абсорбционный спектр хромофора кедарцидина при растворении в метаноле.
На фиг. 3 показан спектр магнитного резонанса хромофора кедарцидина в диметилсульфоксиде-d6 (DMSO-d6) (500.13 МГц).
На фиг. 4 показан спектр магнитного резонанса 13C хромофора кедарцидина в диметилсульфоксида-d6 (125,76 МГц).
Хромофор кедарцидина может быть получен из противоопухолевого кедарцидинового антибиотика, изолированного в патенте США N 5 001 112, или при ферментации питательной среды, используемой для получения кедарцидина. Одним из предпочтительных исходных материалов является очищенный кедарцидин, изолированный и очищенный, как описано в примере 4 выше упомянутого патента США. Другим предпочтительным исходным материалом является материал, полученный путем фильтрации ферментативной питательной среды, культивируемой с кедарцидинпроизволящим штаммом Streptoalloteichus, с последующей анионно-обменной хроматографией фильтрата с использованием в качестве элюанта катионактивного буфера, содержащего хлорид натрия, а также сбор фракции, элюированной с NaCl буфером. Элюат, являющийся результатом хроматографической процедуры, имеет большое количество удаленных примесей, и позволяет получить большой выход желаемого хромофора кедарцидина. Обнаружено, что следует лиофилизировать указанный элюат для хранения перед операцией экстракции, описанной ниже, но также может быть использован водный элюат. Отфильтрованная ферментативная питательная среда также может быть использована в способе согласно изобретению без анионнообменной очистки, но это в свою очередь требует дополнительных операций очистки для получения хромофора и является менее эффективным путем, нежели начинать с очищенным кедарцидином или частично очищенной ферментативной средой, которая подвергалась стадии анионного обмена.
Водный раствор очищенного или частично очищенного кедарцидина, как описано выше, подвергают органической экстракции этилацетатом. Другие органические растворители, такие как кислый метанол, используемый для получения хромофора неокарционостатина, n-бутанол, бензолметанол и хлороформ-метанол, приводят к разложению или образованию эмульсий. Этилацетатный экстракт затем подвергают жидкостной силикагелевой хроматографии, используя в качестве элюанта ступенчатый градиент бензола, содержащий повышенные концентрации метанола. Фракции проверяют с помощью тонкослойной хроматографии (TLC), а затем требуемая фракция, содержащая очищенный хромофор кедарцидина, может быть сконцентрирована под вакуумом для получения продукта в качестве буфер-окрашенного аморфного твердого вещества.
Хромофор кедарцидина имеет следующие физико-химические характеристики:
Описание: буфер-окрашенное аморфное твердое вещество
Стабильность: Очень нестабильный. Разлагается в течение часов в растворе с бензолом, метанолом, хлороформом и диметилсульфоксидом (DMSO).
Молекулярная формула: C53H60N3O16Cl
Молекулярный вес: 1029, 3628
Масс-спектр: Kratos MS50 Масс-спектрометр [M+H]+ 1030, FAB, использующий спирт m-нитротолуола.
Инфракрасный спектр: Perkin Elmez 1800 фурье-спектрометр Transform IR Spectrometer, KBr шарик. Основные IR Ленты (см-1):
3432, 3076, 2976, 2832, 2188, 1742, 1656, 1622, 1524, 1470, 1450, 1434, 1386, 1354, 1298, 1240, 1192, 1164, 1114, 1080, 1060, 1032, 1010, 980, 936, 902, 862, 824, 798, 680.
Ультрафиолетовый спектр: Huolett Packard 8452 A.
Спектрофотометр с диодной матрицей Smax (MeOH): 256,316 нм (log ∈ 4,78, 4,16).
Аналитическая HPLC:
Колонка Q-BEX C18 10μ#10230(жидкостная хроматография высокого давления).
Элюент: 4 части тетрагидрофурана, 6 частей 0,2 М ацетата аммония.
Поток: 2 мл/мин.
Детектор: 254 нм.
Концентрация пробы: 4μг/μл метанола.
Время удержания: 12 мин.
Элементный анализ: Обнаружены: C 58,78; H 5,78; N 3,56.
Качественный тест для Cl: положительный.
Качественный тест для S: отрицательный.
1Н NMR.
1Н ядерный магнитный резонанс:
спектрометр Bruker Model АМ-500,
растворитель: DMSO-d6 (диметилсульфоксид-d6),
замеченные химические сдвиги (отношение к DMSO сигналу δ 2,531).
Здесь и далее:
S синглет
br уширенный
m мультиплет
d дублет
t триплет
q квадруплет.
1,09 (S, 3H), 1,16 (S br, 6H), 1,34 (S br, 6H), 1,74 (m, 2H), 1,92 (m, 1H), 2,05 (d, 1H, I=14,3), 2,36 (m, 1H), 2,46 (S, 6H), 2,86 (m, 2H), 3,21 (m, 1H), 3,78 (S, 3H), 3,95 (S, 3H), 3,95 (m, 1H), 4,04 (m, 1H), 4,09 (m, 1H), 4,12 (m, 1H), 4,27 (m, 1H), 4,30 (m, 1H), 4,34 (m, 1H), 4,53 (S br, 1H), 4,75 (m, 1H), 4,81 (S br, 1H), 5,11 (S br, 1H), 5,44 (S br, 1H), 5,56 (m, 1H), 6,19 (S, 1H), 6,62 (S, 1H), 6,97 (S, 1H), 7,11 (S, 1H), 7,22 (d, 1H, I=8,3), 8,48 (S, 1H), 9,56 (d, 1H, I=7,4).
13C-NMR: cпектрометр Bruker Model АМ-500, растворитель: DMSO-d6, замеченные химические сдвиги (относящиеся к DMSO-сигналам d 39,113; 39,268; 39,447; 39,601; 39,780; 39,935; 40,113) представлены в табл. 1.
Тонкослойная хроматография:
Rf 0,29 бензол-метанол 9:2
Rf 0,16 бензол/метанол 9:1.
Планшет: Uniplate Silica Gel GHLF 0,25 мм толщиной.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ (анализ):
короткая длина волны ультрафиолетового света;
цериевосульфатный распыленный реагент.
Основанная на описанных выше физико-химических характеристиках структура хромофора кедарцидина может быть представлена в следующем виде:
Биологическая активность
Противоопухолевая активность хромофора кедарцидина была оценена в цитотоксичной пробе in vitro относительно некоторых опухолевых линий клеток человека, а также in vivo против пересаживаемого мурина Р388 лейкемии и В-16 меланомы. Описание способов и полученных результатов приведены ниже.
1. Способы
А. Цитотоксичный анализ in vitro
Линии клеток, используемые для оценки in vitro цитотоксичной потенции, включают чувствительную к лекарствам линию колоний аденокарциномы НСТ116 человека, НСТ116/УР35 и НСТ116/УМ45 дочерние стойкие к лекаpствам линии клеток, которые имеют низкий уровень топоизомеразы II и повышенный уровень Р-170 гликопротеина I, соответственно, а также линию клеток, чувствительную к лекарствам, карциномы яичников человека А2780 и дочернюю линию клеток, устойчивую по отношению к лекарствам, A2780/DDP. Линия клеток А2780/DDP считается устойчивой по отношению к усиленным механизмам репарации ДНК и повышенным уровням GSH/GST. Клетки культивировались в среде Маккоя и 10% сыворотке зародыша быка. При логарифмической фазе роста 4х103 клеток/ ячейки были помещены в 96 ячеистые плашки для титрования и инкубированы при 37oC в 95% O2/ 5% CO2 в течение 24 часов для обеспечения закрепления (прикрепления) клеток. Вещества были добавлены в верхний ряд ячеек, серийно разбавлены (4-кратное разбавление) и инкубированы в течении дополнительных 72 часов. Число жизнеспособных клеток в каждой ячейке было затем подсчитано, как ранее описано /2/, путем добавления тетразолиновой краски (ХТТ) с конечной концентрацией 0,05 мг/мл в присутствии метосульфата феназина с конечной концентрацией 0,005 мМ. После инкубирования при комнатной температуре в течение 3 часов для развития окрашивания, значения оптической плотности были замерены с использованием Dynatech MR600 (считывающее устройство с плашек) при 450 нМ. IC50 (концентрация лекарства, ингибирующего рост клеток на 50%) были рассчитаны с использованием анализа линейной регрессии значений оптической плотности. Трехкратное определение на 96 ячеистых плашках было произведено для каждого лекарства на каждой тестируемой линии клеток.
B. МОДЕЛИ in vivo на мышах
1. Модели Р388 лейкемии мышей
Опухоль Р388 поддерживалась в асцитическом состоянии в DBA/2 мышах. Экспериментальные опухолевые модели, использующие CDF1 мышей, были имплантированы внутрибрюшным или внутривенным путем с содержанием клеток лейкемии, равным 1х106 в день 0 и дозированы лекарствами согласно указанному пути и расписанию. Мыши были взвешены в день 0, затем на 5 или на 6 день. Потеря веса, равная 20% или выше, являлась индикатором лекарственной токсичности. Каждая дозируемая группа состояла из 6 мышей по отношению к 10 мышам в необработанной контрольной группе. Дозирующий режим был Q1DX1.
1. Проверки смертей проводились ежедневно и был определен средний жизненный цикл. Увеличение жизненного цикла на 25% и выше в группе, обработанной лекарствами, по сравнению с необработанными контрольными мышами являлось критерием активности (%Т/C>125%). Эксперименты закончились на 30 день или приблизительно к этому дню.
2. Модель твердой опухоли В-16 у мышей
Мышиная меланома В-16 находилась как растущая подкожная опухоль в С57BL/6 мышах. Экспериментальные модели опухоли, использующие BDF1 мышей, имплантированных 25 мг фрагментом опухоли, были имплантированы через троакар в день 0, хромофор кедарцидина был введен по графику Q1DX1; 1. Мыши были взвешены в день 0 и на 9 день.
2. Результаты
A. In vitro
Как показано на таблице ниже, хромофор кедарцидина является исключительно сильным по сравнению с VP-16 (etoposide) в своей способности инигибировать рост клеток (IC50 значения, выраженные в качестве нанограмм вещества/мл, конечная концентрация). Хромофор кедарцидина был в 285 и 1725 раз сильнее, чем УР-16 на двух линиях чувствительных клеток УР-16. Кроме того, хромофор кедарцидина не является перекрестноустойчивым с УР-16 на линиях клеток НСТ116/УР35 или НСТ116/УМ46. При оценке линий клеток А2780 чувствительных и А2780/DDP, УР-16 и хромофор кедарцидина оба были примерно в 6,6 раз менее сильными на линии устойчивых клеток по сравнению с линией чувствительных клеток (см. табл. 2).
B. In vivo
1. Модель Р388 лейкемии мышей
При оценке действия против внутрибрюшного имплантирования Р388 лейкемии мышей хромофор кедарцидина давал соотношение T/C% равное 175 при оптимальной дозе, равной 1 мг/инъек при введении внутрибрюшинно через день после опухолевого импланта. В том же эксперименте имплантированные внутривенно клетки опухоли Р388 также проявляли чувствительность к противоопухолевому действию хромофора кедарцидина. При введении внутривенно через день после импланта опухоли, хромофор кедарцидина давал соотношение Т/C% равное 214, при оптимальной дозе инъекции, равной 0,25 мг/кг. Две различные партии кедарцидина были равным образом эффективны, хотя иногда менее сильными по сравнению с хромофором кедарцидина в данном эксперименте. Противоопухолевая активность хромофора кедарцидина в отношении лейкемии мурина P388 была подтверждена в эксперименте 8328. В этой внутрибpюшинно имплантированной модели, хромофор кедарцидина вводили внутрибрюшинно, Q1DX1; 1, он давал T/C% соотношение, равное 185, при оптимальной дозе 0,25 мг/кг/ инъек. В имплантированной внутривенно части в данном эксперименте хромофор кедарцидина давал соотношение Т/C% равное 186, при оптимальной дозе 0,125 мг/кг/инъек при введении внутривенно по тому же графику. Две различные партии кедарцидина были равным образом эффективны, хотя менее сильны по сравнению с хромофором кедарцидина в данном эксперименте.
В мышиных моделях лейкемии Р388 хромофор кедарцидина был одновременно и сильным и эффективным средством, невзирая на то, какая модель была внутрибрюшная или внутривенная, внутривенная модель использовалась для оценки противоопухолевой активности данного соединения (вещества).
Хромофор кедарцидина был таким же эффективным, как и кедарцидин в модели Р388, но и немного более сильным.
2. Модель твердой опухоли В-16 мышей
В эксперименте 796 противоопухолевая активность хромофора кедарцидина была оценена с использованием модели мышиной меланомы В-16. При подкожном имплантировании опухоли хромофор кедарцидина был активным в отношении критерия жизненного цикла с соотношением Т/C% равном 164, при введении внутривенно через один день после опухолевого импланта при оптимальной дозе 0,062 мг/кг/инъек. В том же эксперименте кедарцидин давал идентичное соотношение Т/C% при оптимальной дозе 0,75 мг/кг/инъек с использованием того же пути и графика. Ни хромофор кедарцидина, ни кедарцидин не были активными в отношении критерия задержки роста опухоли.
3. Заключение
Хромофор кедарцидина проявил значительную противоопухолевую активность в внутрибрюшинно или внутривенно имплантированной модели лейкемии мурина Р388, а также в подкожно имплантированной модели меланомы мурина В-16 в отношении критерия жизненного цикла. Он был таким же активным, а также немного более сильным, что и кедарцидин, при сравнении результатов непосредственно в этих экспериментах.
4. Ссылки
1. Long, B.H. Wang, L. Lorico, A. Wang, R.C.C. Brattain, M.G. and Casazza, A. M. Mechnisms of Resistance to Etoposide and Teniposide in Acquired Resistant Human Colon and Lung Carcinoma Cell Lines. Cancer Research 51; In Press (1991).
2. Scudiero, D.A, Shoemaker, R.H. Paull, K.D. Monks, A. Tierney, S. Nofziger, T.H.Currens, M.J. Seniff, D. and Boyd, M.R. Evaluation of a Soluble Tetrazolium/Formazan Assay for Cell Growth and Drug Sensititity in Culture Using Human and Ofher Tumor Cell Lines. Cancer Research 48: 4827-4833 (1988).
Результаты теста показывают, что хромофор кедарцидина проявляет in vitro сильную противоопухолевую активность в отношении некоторых линий опухолевых клеток человека, а также противоопухолевую активность in vivo в отношении лейкемии мурина Р388 и меланомы В-16 (см. табл. 3-7).
Изобретение включает в свой объем фармацевтические вещества, содержащие эффективное количество, ингибирующее опухоль хромофора кедарцидина в комбинации с фармацевтически пригодным носителем разбавителя. Такие вещества могут содержать также и другие активные противоопухолевые вещества и могут быть получены в любой фармацевтической форме, пригодной для того или иного пути введения. Примеры таких веществ включают твердые вещества для орального введения, такие как, таблетки, капсулы, пилюли, порошки и гранулы, жидкие вещества для орального введения, такие как: растворы, суспензии, сиропы или эликсиры, а также препараты для парентерального введения, такие как стерильные растворы, суспензии или эмульсии. Они могут быть также изготовлены в виде стерильных твердых веществ, которые могут быть растворены в стерильной воде, физиологическом растворе или любой другой стерильной среде для инъекций непосредственно перед использованием.
Для использования в качестве противоопухолевого вещества оптимальные дозировки и режимы введения для данных организмов-хозяев млекопитающих могут быть легко установлены специалистами. Необходимо, конечно, учитывать, что настоящая доза, используемая в каждом случае, может изменяться согласно определенному заданному составу, пути введения и определенного места, хозяина и вылечиваемой болезни.
Необходимо принимать в расчет и многие факторы, которые изменяют действие лекарства, включая возраст, вес, пол, питание, время введения, путь введения, степень (скорость) экскреции, условия пациента, состав лекарства /комбинацию лекарств/, реакции на чувствительность, а также серьезность заболевания.
Настоящее изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами, которые не следует расценивать как ограничивающие объем изобретения. За исключением указанных других соотношений, все соотношения растворов даны в об/об.
Пример 1.
Общие способы:
Вещества:
Использовали хлороформ, бензол, этилацетат и метанол в виде безводных растворителей по стандартам ASC. Тетрагидрофуран свободный от консерванта растворитель для жидкостной хроматографии высокого давления. Эти растворы не подвергались повторной очистке или дистилляции. Вода, используемая в экспериментах по разделению растворов, относится к водопроводной деионизированной воде. Вода, используемая в экспериментах с хроматографией, относится к водопроводной деионизированной воде, пропущенной через систему очистки воды "Millipore-4" 10 metq ohm Milli Q). Ацетат аммония является реагентом для HPLC. Силикагелем для вакуумжидкостной хроматографии являлся Merck Lichroprep Si 60, с размером частиц 25-40 μм. Гидрат сульфата церия и тетрагидрат молибдата аммония (VI) являются реагентами чистоты ASC.
Аналитическая тонкослойная хроматография (TLC)
Были использованы хроматографические пластины (размером 10х 20 см, 250 микрон), предварительно покрытые тонким слоем Uniplate Silica Gel HGLF. Фракции были собраны с использованием одноразовых пипеток "Microcap" объемом 2 микролитра, а пластины были размещены в резервуаре, уравновешенном бензолметанолом /9: 2 об/об/. Составляющие конечной /результирующей/ хроматограммы были проявлены ультрафиолетовым светом с короткой длиной волны и/или распыленным сульфат-цериевым компонентом.
Распыленный сульфат-цериевый реагент
Распыленный сульфат-цериевый реагент для тонкослойной хроматографии был получен путем растворения 6 г гидрата сульфата церия и 28 г тетрагидрата молибдата (VI) аммония в 20% водном растворе серной кислоты (500 мл). Напыленную TLC-пластину затем подвергали нагреванию при температуре около 150oC в течение 5-10 минут.
Аналитическая жидкость хроматография высокого давления
Для создания аналитической системы ЖХВД (HPLC) использовались следующие составляющие: Waters Associates, Модель М-45 растворораспределительной системы; Waters Associates, впрыскиватель Модель 6К; Water Associates, Guard-Pak Precolumn Module c C18 катриджем Q-BEX scientific Jnc C18 (10 микрон) колонка (3,9 внутр.х30 см, QBX-10230). Составляющие были соединены 316 трубками из нержавеющей стал (1,6 мм нар. диаметр 0,23 мм внутренний диаметр). Специальный элюент закачивался при скорости потока, равной 2% 6 мл/мин. Обнаружение проводилось с помощью детекторной системы Hewlett Packard HP-1040A Detector System. Эта система состояла из Детектора с диодной матрицей Hewlett Packard HP-1040A, компьютера НР-85В, Disc Driver НР-9121 и графопостроителя НР-7470.
Очистка хромофора кедарцидина представлена в табл. 8.
Получение экстракта А
Ферментирующую питательную среду для получения кедарцидина приготавливают обычно по примерам 1-3 патента США 5 001 112. Исходную ферментирующую питательную среду подвергают фильтрации и анионнообменной хроматографии для получения элюата, описанного в колонке 13, строке 34 патента США 5 001 112. Этот элюат, содержащий частично очищенный антибиотик кедрацидина, применяют после лиофилизации, в качестве исходного материала в следующей стадии экстракции.
Частично очищенный лиофилизированный кедарцидин (76 г), полученный путем лиофилизации элюата, описанного выше, растворяют в 1100 мл воды. Водный раствор экстрагируют четыре раза с равным объемом этилацетата, используя шестилитровую делительную воронку. Экстракты этилацетата собирают и выпаривают in vacuo до сухого состояния во вращающемся выпаривателе до выхода, равного 0,34 г остатка А.
Вакуумножидкостная хроматография остатка А
Маленькая воронка с пористым фильтром Контеса (2,5 см внутренний диаметрх11 см) была заполнена на три четверти сухим силикагалем (Merk LiChroprep 25-40 μм), 12 г. Колонка была уравновешена 100 мл бензола с использованием вакуума для элюирования растворителя. Остаток А был растворен в этилацетат-метаноле 3: 1 (5 мл) и предварительно адсорбирован на 3 г силикагеля. Проба была доведена до состояния кашицы в бензоле, перенесена в колонку и затем применен вакуум. Используя ступенчатый градиент, элюирование было начато (100 мл каждый) с бензола, 1% метанола в бензоле, 2% 5% и 7,5% метанола в бензоле (3 раза). Хроматограмма была обработана с помощью тонкослойной хроматографии с использованием ультрафиолетового света с короткой длиной волны и распыленного реагента сульфата церия для визуализации. Требуемое вещество было элюировано с первыми 100 мл 7,5% метанола в бензоле. Эта фракция была выпарена до сухого состояния под вакуумом при 25oC во вращающемся выпаривателе с выходом 0,2 г хромофора кедарцидина. ТТТ1 ТТТ2 ТТТ3 ТТТ4 ТТТ5 ЫЫЫ2
Использование: медицинская промышленность, производство антибиотиков. Сущность изобретения: хромофор кедарцидина, небелковый хромофор, изолированный из противоопухолевого антибиотика кедарцидина, получают из очищенного или частично очищенного кедарцидина путем экстракции растворителя и хроматографических процедур. Хромофор отличается тем, что содержит главным образом всю противоопухолевую активность кедарцидина. 2 с.п.ф-лы, 4 ил., 8 табл.
2. Способ получения противоопухолевого антибиотического хромофора кедарцидина формулы
заключающийся в том, что водный раствор кедарцидина экстрагируют этилацетатом, собранный экстракт подвергают колонной хроматографии на силикагеле с использованием бензол-метанолового элюента со ступенчатым градиентом, а фракцию, содержащую хромофор кедарцидин, собирают и выпаривают.
