СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИНА Российский патент 1995 года по МПК A61K38/00 A61K31/00 A61K35/00 A61K35/39 

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается получения биологически активных веществ из органов и тканей животных, конкретно к выделению и очистке инсулина из поджелудочной железы свиньи и крупного рогатого скота.

Инсулин является основным фармакологическим средством при лечении сахарного диабета. Ежедневные инъекции инсулина больным в течение длительного времени предъявляют жесткие требования к чистоте данного лекарственного средства. Даже незначительные примеси белковых компонентов вследствие кумулятивного эффекта в процессе лечения могут привести к летальному исходу. В лучших образцах импортного производства (фирма "Eli Lilly", США, фирма "Novo", Дания) содержание белков с молекулярным весом выше 6000 не превышает 1% . Однако, и столь малые примеси в препаратах инсулина могут вызывать аллергические реакции. Из-за низкого качества инсулина, получаемого в странах бывшего СССР, производство его на некоторых заводах прекращено.

В настоящее время начальный этап выделения инсулина из поджелудочной железы животных является общепринятым и заключается в экстракции гормона из ткани с помощью этилового спирта высокой концентрации, подкисленного до рН 2,0-3,5, как правило, одной из сильных неорганических кислот. Дальнейшее выделение инсулина из спиртового экстракта имеет несколько решений.

Известен способ выделения инсулина из спиртового экстракта поджелудочной железы крупного рогатого скота, в котором инсулин сорбируется на макропористом сульфополистирольном катионите КУ-23 при рН 2,4 без предварительной депротеинизации экстракта (а.с. СССР N 389793). После сорбции смолу последовательно промывают 70%-ным этиловым спиртом и 0,2 М уксусно-аммонийным буфером рН 5,0-5,3. Элюцию инсулина со смолы проводят 0,2 М соляно-аммонийным буферным раствором рН 9,4-9,6, содержащим 15-20% этилового спирта. Элюат подкисляют до рН 2,0, осадок отфильтровывают. Фильтрат доводят конц. аммиаком до рН 4,4, выпавший осадок удаляют, а к супернатанту при рН 6,0 добавляют 10%-ный раствор ацетата цинка для осаждения аморфного цинк-инсулина. Активность целевого продукта составляла 24 МЕ/мг, выход - 2420 МЕ на 1 кг поджелудочной железы. Основным недостатком метода является довольно низкая активность получаемого продукта, что свидетельствует о возможном присутствии больших количеств примесных соединений.

Вышеупомянутый метод содержит основные элементы выделения инсулина, используемые ранее в разработках различных фирм, однако, целевой продукт не удовлетворял требованиям, предъявляемым к данному лекарственному средству. Поэтому было разработано несколько вариантов очистки инсулина. По мнению Zoltobrocki (пат. США N 41295690) освободиться от примесных соединений (особенно от белков, близких по молекулярному весу и родственных белков - проинсулин, дезамидоинсулины, аргинин- и диаргинин-инсулины, этиловые эфиры инсулина) можно только с помощью ионно-обменной хроматографии с использованием в качестве элюентов систем, вызывающих диссоциацию компонентов смеси. В работе использовались водные буферы, содержащие неионные детергенты. Предпочтительными оказались аниониты типа DEAЕ- и QAE-Sephadex A-25, а среди детергентов лучшими свойствами обладали эфиры жирных спиртов и полигликоля. Фирмой "Eli Lilly" разработан способ очистки на сильном анионите, при котором снятие инсулина с сорбента осуществляют с помощью водно-спиртовых растворов рН 5,5-10,0 (ФРГ, пат. N 1966573).Одним из возможных вариантов очистки инсулина рассмотрена также хромотаграфия на декстрановом геле типа Sephadex с размером частиц 0,08-0,1 мм и элюцией 0,5 М уксусной кислотой (пат. США N 3878186). Это позволяет освободиться от высокомолекулярных белков, проинсулина и белков, близких к инсулину по молекулярной массе. В вышеупомянутых методах очистки инсулина в хроматографическом процессе собирают только центральную часть фракций, содержащих инсулин, что неизменно ведет к потере целевого продукта.

Хорошие результаты по очистке инсулина были получены Jackson R.L. (пат. Англия N 2038340), который использовал последовательную хроматографию на анионите DEAE-Sephadex А-25, а затем на сильном катионите SP-Sephadex С-25, проводя элюцию гормона в градиенте хлоpистого натрия и присутствии 7 М мочевины. После обессоливания на Sephadex G-25 или Sephadex G-50, автору удалось практически полностью избавиться от примесей проинсулина, глюкагона и соматостатина.

Надо отметить, что перечисленные методы являются дополнительными к основному процессу и, следовательно, усложняют и без того довольно громоздкую и дорогостоящую схему выделения целевого продукта.

Известен также способ выделения инсулина [1], выбранный нами в качестве прототипа, в котором перед сорбцией инсулина на катионите проводится трехкратное удаление белка из спиртового экстракта. Первую депротеинизацию осуществляют с помощью хлористого кальция при рН 3,5-3,8. После отделения осадка фильтрат подщелачивают до рН 4,7-5,1 и вновь выпавший осадок убирают центрифугированием. В третий раз осаждение белков проводят в течение 2-3 часов при рН 3,7-3,9 и охлаждении смеси до 0-6^o С. После отделения осадка фильтрат пропускают через колонку с сульфокатионитом КУ-23 и далее обработку ведут известным способом. Цинк-инсулин перекристаллизовывают из водного раствора лимонной кислоты, содержащем ацетон, и получают кристаллический инсулин с активностью 26,5 МЕ/мг. Выход составляет 4505 МЕ в пересчете на 1 кг поджелудочной железы. Основными недостатками метода являются: многостадийность, что делает его трудо- и энергоемким; значительное число операций проводится с большими объемами растворов, что затрудняет соблюдение санитарных норм производства; довольно низкая активность целевого продукта.

Целью изобретения является разработка быстрого и дешевого способа выделения инсулина и повышения частоты целевого продукта с использованием только носителей и реактивов отечественного производства. Качество целевого продукта не должно уступать лучшим образцам зарубежных фирм, а по некоторым показателям и превосходить их. Поставленная цель достигается тем, что спиртовой экстракт поджелудочной железы, получаемый известным способом, подщелачивается до рН 6,0-9,5 и выпавший осадок удаляют центрифугированием. Супернатант подкисляют до рН 1,7-4,5 и наносят на колонку с сульфокатионитом. После сорбции колонку промывают последовательно 65% этиловым спиртом, водой и 0,3 М натрий-ацетатным буфером рН 5,0 - 5,3. Инсулин с колонки элюируют 0,01 М фосфатным буфером рН 7,0-8,5, содержащим 0,2-1,0 М хлорид натрия. Элюат подщелачивают до рН 7,5-9,5, добавляют хлорид натрия до концентрации 2,0-4,0 М. Выпавший осадок отфильтровывают, растворяют в системе, содержащей 5-30% ацетонитрила рН 2,0-7,5 и наносят на колонку с носителем типа "Адан". Инсулин с колонки элюируют той же водно-органической системой с концентрацией органического растворителя от 10 до 50% и лиофильно высушивают.

Сущность метода заключается в том, что на первой стадии выделения удаление из спиртового экстракта большого числа сопутствующих веществ проводится в щелочной области в один прием. Спиртовый экстракт подщелачивается с помощью 10 М гидроокиси натрия или калия или конц. аммиака до рН 6,0-9,5 и выпавший осадок удаляют центрифугированием. Супернатант подкисляют с помощью конц. раствора сильной кислоты (серная, соляная или фосфорная кислоты) до рН 1,7-4,5 и наносят на колонку с сильным катионитом. Для сорбции инсулина впервые использован сильный катионит на основе силикагеля. Диасорб-сульфо. После сорбции колонку отмывают от липидов сначала системой нанесения рН 1,7-4,5, а затем 65% раствором органического растворителя (в качестве органического растворителя можно использовать ацетонитрил, метиловый, этиловый, пропиловый и изобутиловый спирты), водой и балластные белки элюируют с колонки 0,3 М ацетатным буфером рН 5,0-5,3.

Инсулин с колонки десорбируют 0,01 М фосфатным буфером рН 7,0-8,5, содержащим 0,2-1,0 М хлорид натрия. Элюат подщелачивают с помощью раствора гидроокиси натрия до рН 7,0-9,5 и добавляют хлдорид натрия до концентрации 2,0-4,0 М. Выпавшие кристаллы отфильтровывают и после растворения хроматографируют на колонке с носителем "Адан". "Адан" является гидрофобным носителем на основе макропористого стекла и впервые используется для выделения и очистки инсулина. Для нанесения инсулина на колонку могут быть использованы как водные, так и водно-органические системы с концентрацией органического растворителя в диапазоне 5-30% в области рН 2,0-7,5. В качестве растворителя может использоваться тот же набор органических растворителей, что и в случае работы на колонке с сульфокатионитом. После промывки колонки системой нанесения гормон элюируется той же водно-органической системой, но с более высоким содержанием органических растворителей (от 10% до 50%). Элюат либо лиофильно высушивают, либо инсулин осаждают в виде цинковой соли после добавления 1%-ного раствора ацетата цинка.

Для дальнейшей очистки препарат инсулина рехроматографируют на колонке с "Аданом" в тех же условиях. Чистоту получаемого продукта контролируют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с использованием трицинового буфера (Anal.Biochem. 166,368-379, 1987). Гель фиксируют формальдегидом или глутаровым диальдегидом и окрашивают раствором азотнокислого серебра (в разработке авторов). Этот вариант проявления и фиксации геля имеет преимущество перед широко распространенным методом окрашивания с помощью Coomaccie G-250, поскольку он предотвращает вымывание с геля низкомолекулярных белков, легко растворимых в кислых водно-спиртовых системах, и позволяет обнаружить даже микропримеси таких компонентов (менее 0,2%).

В предлагаемом способе выделения и очистки инсулина были использованы носители, приготовленные на основе силикагеля и макропористого стекла - катионит Диасорб-сульфо и гидрофобный носитель "Адан". Оба носителя отечественного производства и используются для выделения и очистки инсулина впервые. В отличие от сульфополистирольных носителей типа КУ-23 и Dowex 50х2 носители на основе силикагеля и макропористого стекла (Диасорб-сульфо и "Адан") апирогенны, что является большим преимуществом при использовании их в производстве лекарственных средств.

Основные преимущества предложенного способа по сравнению с прототипом заключаются в следующем:
сокращено количество операций - четыре операции при выделении и две операции при очистке целевого продукта, что в свою очередь значительно удешевляет весь процесс и сокращает время его проведения;
после второй операции рабочие объемы уменьшаются практически в 10 раз, что упрощает технологию и облегчает соблюдение санитарных норм производства;
количество энергоемких операций (центрифугирование, упаривание) сокращено до минимума;
содержание сопутствующих белковых примесей в инсулине, получаемом по предложенному способу, по данным электрофореза в полиакриламидном геле ниже, чем в лучших образцах импортного производства.

Метод прост в реализации и выполняется на носителях и с помощью реактивов отечественного производства, не требует дорогостоящего оборудования. В лабораторных условиях проведение всех операций по выделению целевого продукта, начиная с осаждения сопутствующих компонентов из спиртового экстракта и кончая лиофилизацией, занимает 3-4 дня.

П р и м е р 1. Выделение инсулина крупного рогатого скота. К 1 л спиртового экстракта поджелудочной железы крупного рогатого скота, полученного известным способом, с использованием фосфорной кислоты, добавляют конц. раствор аммиака, доводя рН до 6,0. Выпавший осадок удаляют центрифугированием, супернатант подкисляют конц. соляной кислотой до рН 2,7-3,0 и наносят на колонку (1,5х17 см), заполненную Диасорбом-сульфо и уравновешенную 65% -ным этиловым спиртом в 0,01 н. ацетате натрия рН 2,7-3,0, со скоростью 50 мл/ч. После сорбции колонку последовательно промывают той же системой, 65% -ным этиловым спиртом, затем 20%-ным хлороформом в 65%-ном этиловом спирте, 65% -ным этиловым спиртом и водой. Балластные белки удаляют промыванием колонки 0,3 М ацетатом натрия рН 5,0-5,3. Инсулин элюируют с колонки 0,01 М фосфатным буфером рН 7,0-8,2, содержащим 0,3 М хлорид натрия. К элюату добавляют сухой хлорид натрия с тем, чтобы конечная его концентрация составляла 2,8 М. Выпавшие кристаллы инсулина растворяют в 10%-ном водном растворе ацетонитрила рН 2,0-2,6. Нерастворившийся остаток удаляют центрифугированием и прозрачный супернатант наносят на колонку 0,6х12 см, заполненную гидрофобным носителем "Адан" и уравновешенную той же системой, со скоростью 50 мл/ч. После промывки колонки системой нанесения инсулин элюируют 30%-ным водным ацетонитрилом рН 2,2-2,6 со скоростью 30 мл/ч. Элюат лиофильно высушивают. Выход - 25 мг, что составляет 100 мг инсулина на 1 кг поджелудочной железы. Активность - 28,5 МЕ/мг. Чистоту препарата проверяют по электрофорезу в 16% полиакриламидном геле с использованием трицинового буфера, гель окрашивают серебром.

П р и м е р 2. Выделение и очистка инсулина свиньи. К 400 мл спиртового экстракта поджелудочной железы свиньи добавляют конц. аммиак до рН 6,0 и далее обрабатывают и наносят на колонку с сульфокатионитом. Диасорб-сульфо, как описано в примере 1. Фракцию инсулина в 0,01 М фосфатном буфере подкисляют 1 М соляной кислотой до рН 2,5-2,8, добавляют ацетонитрил до концентрации 10% и наносят на колонку с "Аданом", уравновешенную 10%-ным водным раствором ацетонитрила рН 2,5-2,8. Обработку колонки и элюцию инсулина ведут так же, как описано в примере 1. К раствору инсулина в 30%-ном водном ацетонитриле добавляют 1 М гидроокись натрия до рН 7,5 и 0,5 мл 1%-ного раствора хлорида цинка. Выпавшие кристаллы отфильтровывают, растворяют в 20 мл 10% -ного ацетонитрила рН 2,5-2,8 и рехроматографируют на колонке с "Аданом". Выход - 10 мг, что составляет 100 мг на 1 кг поджелудочной железы.

П р и м е р 3. Очистка инсулина свиньи. 33 мг инсулина свиньи (Белорусское производственное объединение медицинских препаратов) растворяют в 11 мл 0,01 н. соляной кислоты и наносят на колонку 0,6х17 см, заполненную носителем "Адан" и уравновешенную водой, со скоростью 30 мл/ч. После сорбции колонку промывают водой и инсулин элюируют водным 50%-ным ацетонитрилом. Элюат лиофильно высушивают. Выход - 83%. Активность - 28,5 МЕ/мг.

Сущность изобретения: способ получения инсулина из поджелудочной железы животных основан на сорбционной хроматографии с использованием носителей на основе силикагеля и макропористого стекла отечественного производства. Выделение инсулина из спиртового экстракта состоит из 4 операций, очистка включает 2 - 3 операции. По данным электрофореза в полиакриламидном геле инсулин, получаемый по предлагаемому способу, практически не содержит примесей белков (менее 0,1%). Выход - 25 мг из 1 л спиртового экстракта. Метод прост в исполнении и не требует дорогостоящего оборудования. 1 з.п. ф-лы.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИНА, включающий обработку спиртового экстракта поджелудочной железы животных при кислом значении pH, отделение осадка, хроматографию надосадочной жидкости на сульфокатионите с последующей элюцией целевого продукта и кристаллизацией его в виде Na- или Zn-солей, отличающийся тем, что перед подкислением подщелачивают, центрифугируют, надосадочную жидкость после подкисления хроматографируют на сульфокатионите на основе силикагеля Диасорб-сульфо, а элюцию проводят натрий-фосфатным буферным раствором pH 7,0 - 8,5, содержащим 0,1 - 1М хлорид натрия, затем снова хроматографируют на гидрофобном носителе "Адан" на основе макропористого стекла в водных или водно-органических системах pH 2,0 - 7,5 с концентрацией органического растворителя от 5 до 30%, а элюцию целевого продукта проводят теми же водноорганическими системами с концентрацией растворителя от 20 до 50%. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что хроматографию на колоке с носителя "Адан" проводят последовательно дважды.