ГИСТОХИМИЧЕСКИЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛОКАЛИЗАЦИИ ПЕРОКСИДАЗЫ В СОЧНОЙ РАСТИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ Российский патент 1996 года по МПК G01N33/50 C12Q1/28 

Предлагаемый способ относится к гистохимическим методам исследования растительных тканей. Позволяет определять локализацию пероксидазы в клеточных структурах сочной ткани плодов сладкого перца на основании качественной реакции окисления гваякола перекисью водорода в присутствии фермента. Разработанная методика определения пероксидазы в тонких срезах может быть использована в различных научных исследованиях с целью изучения локализации фермента при технологической или другой обработке.

Аналогом данного метода может служить формальдегид-ортодианизидиновый метод гистохимического определения активности тканевой каталазно-пероксидазной системы (Резников А.Ю. Перова Т.П. Породенко В.А. Диагностические показатели состояния каталазно-пероксидазной системы в танатогенезе алкогольных интоксикаций Тез. докл. 2-го Всероссийского съезда медиков. Иркутск
Москва, 1987, с. 201). Сущность аналогичного метода заключается в приготовлении блоков исследуемого образца, фиксации их в растворе формалина, изготовлении из фиксированных блоков серийных срезов и проведении на них качественной реакции на каталазно-пероксидазную систему. Однако, аналогичный метод предназначен для определения каталазы в животных или трупных тканях. Условия фиксации блоков исследуемых образцов и реакционной смеси для определения пероксидазно-каталазной системы разработаны для трупной ткани и не могут быть перенесены для работы с сочной растительной тканью плодов перца.

Аналогичными для предлагаемого изобретения являются способы гистохимического определения растительной пероксидазы, описанные В. Г. Конаревым ("Цитология и гистохимия растений"- Высшая школа, 1966) и З.П.Паушевой ("Практикум по цитологии растений"- Колос, 1974).

Ближайшим прототипом может служить способ определения пероксидазы гваяколовой реакцией по методу К.Т.Сухорукова (Г.Г.Фурст "Методы анатомо-гистохимического исследования растительных тканей" Наука, 1979, с.123). Указанный способ предполагает выполнение с помощью опасной бритвы срезов растительной ткани, расправление срезов в дистиллированной воде, обработку их насыщенным раствором гваякола и 1%-ным раствором перекиси водорода и последующее микроскопирование. Однако отсутствие при таком анализе фиксации образцов высоковлажной сочной ткани затрудняет выполнение тонких (до 20 мкм) расправленных срезов. Кроме того, при обработке нефиксированных срезов дистиллированной водой и, в последующем, реакционной смесью наблюдается диффузия фермента. Эти факторы осложняют гистохимический анализ, приводят к погрешности определения локализации пероксидазы в растительных тканях.

Техническим решением задачи данного изобретения является подготовка к гистохимическому анализу ткани плодов перца и определения в ней локализации пероксидазы.

Для решения этой задачи предусматривается фиксация блоков ткани плодов перца в 8-10%-ном растворе формалина в 1/15 М-ном фосфатном буфере рН 6,8-7,2. Фиксацию проводят при комнатной температуре в течение 3-4 суток. Далее блоки растительной ткани промывают в 1/14 М-ном фосфатном буфере рН 6,8-7,2 и выполняют из них серийные срезы толщиной 10-15 мкм в криостате-микротоме. Для проведения качественной реакции срезы помещают в реакционную смесь, которая содержит 0,5 М раствора KNO₃, фосфатный буфер рН 6,8-7,2, 0,02 М раствор гваякола и 1% -ный раствор перекиси водорода. Реакцию проводят в течение 40-50 мин в термостате при температуре 37^oС. Прореагировавшие срезы заключают в полистирол и микроскопируют. На фиг.1 изображена фотография тонкого среза сладкого перца, подготовленного и прореагировавшего описанным выше способом. Увеличение микроскопа при фотографировании составило ОБ 15•ОК 20.

Очевидно, что предлагаемый способ обработки блоков растительной ткани позволяет фиксировать пероксидазу в клетках, избегать диффузию фермента в реакционную смесь. При фиксации растительная ткань сладкого перца приобретает упругость, необходимую для выполнения срезов желаемой толщины. Установлено, что предлагаемая фиксация не инактивирует растительную пероксидазу. Избирательность действия выбранного субстрата и "комфортные" условия реакции обуславливают специфичность способа в отношении пероксидазы перца. Качественная реакция окисления гваякола перекисью водорода дает окрашенные продукты в присутствии пероксидазы, что при микроскопировании позволяет судить о локализации этого фермента в клетке.

П р и м е р. Проводилось исследование локализации пероксидазы в ткани плода сладкого перца. В качестве объекта исследования был выбран сладкий перец технической спелости сорта "Подарок Молдовы". Из плодов перца острой битвой вырезали блоки размером 1•0,5•0,5 см и помещали в фиксируемую смесь. Фиксирующим агентом служил раствор нейтрального формалина в 1/15 М фосфатном буфере рН 7,0. Оптимальные результаты фиксации получены при концентрации формалина 85. Фиксацию проводили при температуре 20^oC в течение 3-х суток. Далее блоки ткани перца промывали в 1/15 М фосфатном буфере рН 7,0 и выполняли из них срезы толщины 15 мкм в криостате-микротоме. Полученные срезы помещали в реакционную смесь, содержащую:
[KNO₃] 5•10^-1 M.25%
1/15 М фосфатный буфер рН 7,0.25%
[гваякол] 2•10^-2 М.25%
[H₂O₂ 1%25%
Реакцию проводили на свободно плавающих срезах при температуре 37^oС в течение 50 мин. Микроскопирование заключенных в полистирол прореагировавших срезов выявило гранулированную красно-коричневую окраску, свидетельствующую об окислении гваякола перекисью водорода в присутствии пероксидазы перца в местах ее нативной локализации. Таким образом, предложенный способ позволяет определять локализацию пероксидазы в клетках растительной ткани перца и на основании этого судить о состоянии или причинах изменения активности фермента.

Установлено, что результат качественной реакции на пероксидазу, проводимой на фиксированных срезах описанным выше способом, очевиден при следующих предельных исходных соотношениях реагирующих веществ (таблица). ТТТ1

Использование: научно-исследовательская практика, пищевая промышленность, селекция. Сущность изобретения: из ткани плода перца вырезают небольшие (примерно 1•0,5•0,5 см) блоки, которые предварительно фиксируют в 8-10%-ном растворе формалина, приготовленном на 1/15 М фосфатном буфере с рН 6,8-7,2, в течение 3-4 суток при комнатной температуре, затем из отмытых от фиксатора блоков получают серийные среды толщиной 10-15 мкм, инкубируют их 40-50 мин в реакционной смеси следующего состава: 0,5 М KNO₃ 20-28%, 1/15 М фосфатный буфер 20-30%; 0,02 М гваякол 20-30%, и 1%-ный раствор H₂O₂ 20-30%, заключают в полистирол и микроскопируют. Локализацию пероксидазы устанавливают по появлению коричневых зерен с четкими контурами. 1 табл.

Гистохимический способ определения локализации пероксидазы в сочной растительной ткани, включающий приготовление блоков исследуемого образца, получение срезов, инкубацию их с гваяколом и H₂O₂ и последующее микроскопирование, отличающийся тем, что в качестве исследуемого образца используют ткань плодов сладкого перца, полученные блоки предварительно фиксируют при температуре 20-25°С в течение 3-4 суток в 8-10%-ном растворе формалина на 1/15 М фосфатном буфере с рН 6,8-7,2, промывают их тем же буфером, а срезы инкубируют в течение 40-50 мин при 37°С в реакционной смеси следующего состава, об.

0,5 М KNO₃ 20-28
1/15 М фосфатный буфер 20-30
0,02 М гваякол 20-30
1%-ный раствор H₂O₂ 20-30