СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРОМБОЦИТОВ Российский патент 1996 года по МПК A61K35/14 

Изобретение относится к медицине, точнее к гематологии и вопросу получения клеток крови и их заменителей.

Известен способ получения тромбоцитов, включающий последовательное дифференциальное центрифугирование индивидуальных доз крови с последующей отмывкой. При первом мягком центрифугировании крови осаждаются эритроциты и лейкоциты. При втором, более жестком центрифугировании осаждаются тромбоциты. Полученные тромбоциты отмываются различными солевыми средами. /"Клетки костного мозга и периферической крови", О.К.Гаврилов. Г.И.Козинец, Н.Б.Черняк, Москва, "Медицина", 1985 г. с. 227 231/.

Недостатком указанного способа получения тромбоцитов является то, что для его осуществления, для получения нужного количества тромбоцитов, требуется большое количество крови, которое может быть взято у нескольких доноров, которые должны быть подобраны по антигенам АВО и НА, что сделать очень сложно /"Иммунобиология для практических врачей", Хью Р.К.Барбер, Москва, "Медицина", 1980 г. с. 137 138/. Очистка не обеспечивает освобождение тромбоцитов от примеси эритроцитов и лейкоцитов полностью, а также от веществ, преимущественно белковой природы, определенных плазмой крови, которые обволакивают тромбоциты толстым слоем снаружи. /"Геморрагические заболевания и синдромы", З.С.Баркаган, Москва, "Медицина", 1980 г. с. 14 15/.

Целью настоящего изобретения является устранение указанных недостатков, т. е. создание способа получения тромбоцитов, полностью свободных от факторов, определенных плазмой крови и других форменных элементов ее, имеющих наперед заданные характеристики, и экономии крови.

Указанная цель достигается тем, что тромбоциты, полученные из малого количества крови путем дифференциального центрифугирования, помещают в среду, содержащую определенный набор химических веществ, и выдерживают в ней при определенных физических и химических условиях, при соблюдении условий строгой стерильности. т.е. дополнительно производится культивирование тромбоцитов в питательной среде, что и определяет возможность их получения в большом количестве, при минимальной затрате крови. Полученные таким способом тромбоциты не несут на своей мембране факторы, определяемые кровью донора. Выделение тромбоцитов из среды производится фильтрованием или центрифугированием с одновременной отмывкой солевыми средами. Среда, применяемая для культивирования тромбоцитов, имеет следующие компоненты в мг/л:
Хлористый кальций 3 200
Хлористый калий 5 10000
Хлористый цинк 0,01 100
Натрий фосфорнокислый двухзамещенный 5 10000
Cульфат магния 0,01 100
Гексацианоферрат /II/ калия 0,01 200
DL лейцин 3 2000
DL серин 1,9 1500
DL триптофан 0 500
L цистеин 0 400
L гистидин 1,7 1500
L аргинин 0,6 500
L глютаминовая кислота 1,1 1000
DL метионин 0,5 500
L пролин 0,8 1000
L аспарагин 0,9 1000
DL Лизин 0 700
L глютамин 0 500
Аминоуксусная кислота 0,3 500
Сахароза 100 10000
Аденозинтрифосфат 0 2000
Фолиевая кислота 0,01 0,5
Тиамина бромид 0,01 1
Пангамат кальция 0,01 0,5
Пиридоксина гидрохлорид 0,01 0,5
Цианокобаламин 0,01 0,5
Аскорбиновая кислота 0,01 1
Вода дистиллированная один литр
Сахарозу можно заменить инозитом, дульцитом или маннитом, взяв их в том же количестве.

Культивирование тромбоцитов возможно при условии восполнения потребляемого ими кислорода. Поэтому культивирование можно проводить в тонком слое при доступе к поверхности свежего воздуха, или применив продувание питательной среды воздухом мелкими пузырями, что дополнительно предотвращает агрегацию тромбоцитов.

Добавив в среду агар-агар, можно получить твердую питательную среду, при этом можно не вводить углеводы, т.к. тромбоциты разжижают агар-агар.

Культивирование можно производить в стеклянной посуде, но нужно учесть, что примеси в стекле влияют на интенсивность роста, поэтому желательно использовать кварцевое стекло. Форма посуды может быть любой.

Культивирование производится в термостате при температуре 0 44^oС в течение 1 50 суток. Первый этап развития культуры тромбоцитов, выделенных из крови, занимает длительное время, для его сокращения нужен редкий посев и отмывание тромбоцитов, например, 0,9% раствором хлористого натрия, перед посевом. Культура после последующих пересевов развивается быстрее. Срок развития может служить индикатором чистоты культуры.

Применяя известные методы пересева с жидкой питательной среды на твердую и обратно, можно добиться желаемой однородности и очистки тромбоцитов.

Экономию крови можно считать полной, т.к. она используется только для первоначального посева.

Конечным продуктом являются тромбоциты, образовавшиеся в результате некоторого деления исходных тромбоцитов, полученных из крови, при их росте и размножении на искусственной питательной среде. Поэтому способ дает возможность получить нужное количество тромбоцитов, свободных от плазмы крови и антигенов, определяемых ею.

Пример конкретного исполнения.

Способ включает приготовление питательной среды, взятие крови, выделение и отмывку тромбоцитов, посев, культивирование, выделение из среды культивирования и промывку.

Для приготовления 100 миллилитров питательной среды заготовляются навески следующих веществ в мг.

Хлористый кальций 5
Хлористый калий 300
Хлористый цинк 0,01
Натрий фосфорнокислый двухзамещенный 50
Сульфат магния 0,01
Гексацианоферрат /II/ калия 0,01
DL лейцин 3
DL серин 1,9
DL триптофан 0,37
L цистеин 0,28
L гистидин 1,66
L аргинин 0,63
L глютаминовая кислота 1,1
DL метионин 0,52
L пролин 0,76
L аспарагин 0,86
DL лизин 0,9
L глютамин 0,26
Аминоуксусная кислота 0,22
Сахароза 200
Фолиевая кислота 0,01
Пангамат кальция 0,01
Аминокислоты и витамины растворяются, каждая в отдельности, в 2 мл воды /вода везде используется дистиллированная, фармакопейная/. В чистую /вся посуда моется хозяйственным мылом, с последующей обработкой хромовой смесью/ колбу, емкостью 250 мл, наливается 50 мл. воды. В ней растворяют хлористый калий, хлористый кальций, хлористый цинк, натрий фосфорнокислый двухзамещенный, сульфат магния, гексациноферрат/II/калия и сахарозу. В полученный раствор вливают растворы аминокислот и витаминов. Объем раствора доводят водой до 97,5 мл. Колбу закрывают ватно-марлевым тампоном и раствор стерилизируют в автоклаве при давлении 0,5 атмосферы в течение 10 минут. В остывший раствор стерильно добавляют 2 мл 1% раствора аденозинтрифосфата и 0,5 мл. смеси следующего состава в мл.

Тиамина бромид 6% раствор 0,05
Пиридоксина гидрохлорид 5% раствор 0,05
Цианокобаламин 10% раствор 0,05
Аскорбиновая кислота 5% раствор, разбавленный в 10 мл воды 0,05
30 мл полученной среды переливают в колбу емкостью 100 мл, и к ней добавляют 750 мг выщелоченного агар-агара. На водяной бане добиваются растворения агара и полученный раствор разливают в две чашки Петри, которые стерилизуют в автоклаве при 0,5 атмосферы 10 минут. Твердую и жидкую питательные среды помещают в термостат на 72 часа при температуре 37^oС, для проверки стерильности. Одновременно среды обогащаются кислородом.

Культивирование производится в следующем устройстве. Пробирка с отводом закрывается резиновой пробкой с отверстием, в которое пропущена стеклянная трубка, доходящая до дна пробирки. Нижний конец трубки имеет отверстие диаметром 0,01 мм. Снаружи в пробку вставляют керамический бактериальный фильтр, для стерилизации воздуха. Отвод пробирки закрыт плотной ватной пробкой и на него надета резиновая трубка, пережатая зажимом. Приготовленный прибор в двух экземплярах стерилизуется в автоклаве при 1 атм. 0,5 часа. Пробирки заполняют жидкой питательной средой в количестве 10 мл каждая. Емкость пробирок с отводом 50 мл.

Для получения тромбоцитов, для посева берут 0,05 мл крови донора из пальца, кожу обрабатывают бензином, формалином, спиртом и йодом, под контролем ультрафиолетового облучения в настольном боксе, в который вводится только кисть донора, одетая в перчатку. Сделав укол прокаленной иглой, набирают в шприц 0,05 мл, в котором находится 5 мл 0,9% раствора хлористого натрия, энергично встряхивают и переносят в центрифужную пробирку, закрытую пробкой. Раствор крови центрифугируют при ускорении 4 м/сек² 5 минут. Надосадочную жидкость переливают в чистую центрифужную пробирку и вновь центрифугируют при ускорении 24 м/сек² 10 минут. Надосадочную жидкость отсасывают, оставляя в пробирке 0,1 мл жидкости. Содержимое пробирки разводят 5 мл. 0,9% раствора хлористого натрия и вновь центрифугируют при ускорении 24 м/сек² 5 минут. Надосадочную жидкость сливают, содержимое пробирки перемешивают, для переведения тромбоцитов во взвешенное состояние. Смесь тромбоцитов переносят в пробирку с питательной средой.

Пробирка, с посеянными в питательную среду тромбоцитами, помещается в термостат в наклонном положении, под углом 30^o к горизонту, при температуре 37^oС. Через каждые два часа производится продувание питательной среды воздухом 2 минуты. Для этого, резиновую грушу, выжав из нее воздух, соединяют с отводом пробирки, освобождают грушу и снимают зажим с трубки. Воздух проходит через питательную среду мелкими пузырями. Пробирку при этом располагают вертикально. Наличие роста проверяют, наблюдая раздавленную каплю в микроскопе при увеличении в 600 раз. Через 192 часа из пробирки производят посев на агаризованную среду, для проверки чистоты и выделения чистой культуры от одной клетки. Для этого, из пробирки петлей набирают среду, растирают ее по поверхности агаризованной среды и той же петлей делают посев во второй чашке. Чашки помещают в термостат при 37^oС. Через 48 чесов наблюдают выросшие колонии в микроскоп при увеличении в 105 раз. Отдельные колонии тромбоцитов на гладкой поверхности агаризованной питательной среды имеют диаметр до 5 мм. Форма круглая, полупрозрачная. Поверхность блестящая, гладкая. Структура зернистая. Цвет светло-бронзовый, у молодых заметен только на просвет, напоминают каплю воды на поверхности при условии смачиваемости. Профиль выпуклый. Край ровный. В месте плотного посева колонии сливаются. Консистенция студенистая. В воде плохо эмульгируют. В толщу агара не развиваются. Отдельную колонию переносят во вторую пробирку. Культивирование производится при тех же условиях. За 48 часов происходит развитие тромбоцитов до плотности 2,4х10⁹ в одном мл среды, при посеве 2 колоний диаметром 4 мм в 10 мл питательной среды. /Скорость развития культуры тромбоцитов при первых посевах сильно зависит от состояния здоровья донора/.

Тромбоциты от среды отделяют центрифугированием при ускорении 24 м/сек². Надосадочную жидкость заменяют 0,9% раствором хлористого натрия, размешивают и вновь центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают и в осадке получают тромбоциты.

Технико-экономическая или иная эффективность.

При посеве тромбоцитов в питательную среду с плотностью 10⁶ клеток на один литр за 48 часов культивированием получается 2,4х10¹² клеток, при этом, для первоначального посева использовалось 0,05 мл крови. В одном литре крови здорового человека содержится в среднем 0,3х10¹² тромбоцитов. Следовательно, для получения тромбоцитов один литр питательной среды заменяет 8 литров донорской крови, при условии 100% выхода тромбоцитов из последней.

Получаемые способом культивирования тромбоциты не содержат примесей, определяемых кровью донора.

Полученные таким образом тромбоциты могут быть использованы для производства лекарственных препаратов, и свойства их могут регулироваться составом среды.

Способ получения тромбоцитов относится к гематологии. Цель изобретения - экономия крови и повышение степени очистки тромбоцитов. Тромбоциты культивируются в синтетической питательной среде. Способ включает операции: выделение тромбоцитов из крови дифференциальным центрифугированием, приготовление жидкой и твердой питательной сред, посев тромбоцитов в жидкую питательную среду, посев на твердую питательную среду, посев на жидкую питательную среду, выделение тромбоцитов из среды и их промывка солевыми растворами. Культивирование производится при температуре 0 - 44^oС в течение 1 - 45 суток при аэрации. Полученные тромбоциты и среда после культивирования в ней тромбоцитов могут быть использованы как сырье при производстве лекарственных препаратов.

Способ получения тромбоцитов, включающий выделение тромбоцитов из крови дифференциальным центрифугированием и отмывку их, отличающийся тем, что, с целью экономии и повышения степени очистки, выделенные тромбоциты культивируют при 0^o 44^oС в течение 2 • 10⁵ 3 • 10⁶ с при аэрации в питательной среде, содержащей следующие компоненты, мг/л:
Хлористый кальций 3 200
Хлористый калий 5 10000
Хлористый цинк 0,01 100,0
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 5 10000
Сульфат магния 0,01 100,0
Гексацианоферрат (II) калия 0,01 200,0
Лейцин 3 2000
Серин 1,9 1500,0
Триптофан 0 500
Цистеин 0 400
Гистидин 1,7 1500,0
Аргинин 0,6 500,0
Глютаминовая кислота 1,1 1000,0
Метионин 0,5 500,0
Пролин 0,8 1000,0
Аспарагин 0,9 1000,0
Лизин 0 700
Глютамин 0 500
Аминоуксусная кислота 0,3 500,0
Сахароза 100 10000
Инозит 100 10000
Дульцит 0 10000
Маннит 0 10000
Ащенозинтрифосфат 0 2000
Фолиевая кислота 0,01 0,5
Тиамина бромид 0,01 1,0
Пангамат кальция 0,01 0,5
Пиридоксина гидрохлорид 0,01 0,5
Цианокобаламин 0,01 0,5
Аскорбиновая кислота 0,01 1,0
Вода дистиллированная До 1 л