ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ИНИЦИАЦИИ МОРФОГЕННОГО КАЛЛУСА КУКУРУЗЫ Российский патент 1996 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биологическим исследованиям сельскохозяйственных растений методом культуры клеток и тканей, и может быть использовано в работе по созданию новых форм растений, в частности сортов и исходных форм кукурузы, обладающих хозяйственно-ценными признаками.

Одним из лимитирующих факторов для применения клеточных технологий в процессах создания новых сортов с хозяйственно-ценными признаками является низкий выход регенерантов.

Известны способы регенерации растений кукурузы в культуре тканей (СССР, Авт. св. N 1446155; ЕПВ, заявка N 0160390; Green C.E. Somatic embryogenesis and plant regeneration from the callus of Zea mayz L. in: Proc. 5th. Int'l. Congr. Plant tissues and cells, Akio Fujiwara ed. Japanese Assotiation of Plant Tissue Culture. pub. Tokyo, Japan, 1982) (см. напр. Andrew S.Wang, Callus induktion and plant regeneration from maize mature embryos, Plant Cell Reports, 1987, 6, p. 260 362). (Armstrong C.L. Green C.E. Achievement and maintenance of friable embryogenic callus of maize and involvement of L-proline, Planta, 1985, 6, v. 164, N 2, p. 207 214). Все они включают в себя по меньшей мере три стадии: получение и отбор морфогенных (эмбриогенных) каллусов, пассирование каллусов и получение растений-регенерантов. Для получения максимального выхода растений-регенерантов одинаково важным являются все стадии. Одной из наиболее важных стадий является стадия получения первичных морфогенных каллусов кукурузы. Увеличение частоты образования таких каллусов способствует увеличению выхода конечной продукции - растений-регенерантов, генотипического разнообразия этих растений (сомаклональных вариантов), процессы клеточной селекции на большей выборке каллусного материала проходят успешнее.

Известные методы культивирования эмбриогенных каллусов кукурузы предполагают культивирования на средах стандартного солевого состава: и получение каллусов, и поддержание их роста, и регенерация растений производится в основном на среде Мурасиге и Скуга или среде Чу-вонга (см. напр. Armstrong C.L. Green C.E. Achievement and maintenance of friable embryogenic callus of maize and involvement of L-proline, Planta, 1985, 6, v. 164, N 2, p. 207 214; Andrew S. Wang, Callus induktion and plant regeneration from maize mature embryos, Plant Cell Reports, 1987, 6, p. 260 - 362). Однако морфогенетические процессы, происходящие на каждой стадии культивирования, физиологически существенно различаются и, следовательно, условия культивирования и солевой состав от стадии к стадии должен изменяться).

Известен способ получения морфогенного каллуса кукурузы (заявка N 4771942/13, положительное решение от 11.06.90), выбранный нами в качестве прототипа, включает получение и поддержание эмбриогенных каллусов кукурузы на средах с тремя ауксинами: Пиклорамом, Дикамбой, 2,4Д. При совместном внесении ауксинов достигается увеличение выхода эмбриогенного каллуса. Однако состав минеральных компонентов питательной среды в этом способе не является оптимальным и выход эмбриогенных каллусов можно дополнительно увеличить.

Целью изобретения является увеличение частоты образования морфогенного каллуса кукурузы. Это в конечном итоге увеличивает возможности по использованию биотехнологических подходов для создания новых форм растений.

Указанная цель достигается тем, для получения морфогенных каллусов используется питательная среда следующего состава (табл. 1).

Способ осуществляется следующим образом. В качестве эксплантатов использовались незрелые зародыши кукурузы сорта Шиндельмайзер, линий ИК 226-ТВ, А 554, размером 1,5 2,5 мм (15 20 дней после опыления). Незрелые семена поверхностно стерилизовали в 0,1%-м растворе сулемы, после промывки из них вычленялись незрелые зародыши и высаживались щитком вверх на среду указанного выше состава. Культивировали в темноте при 29 32^oС в течение трех недель. Через 3 недели определяется частота образования морфогенного каллуса.

Для регенерации растений эмбриогенные каллусы переносят на среду с 0,1 мг/л 2,4-Д, 0,1 мг/л Дикамба, 0,1 мг/л Пиклорам, 50 мг/л триптофана, 5 мг/л аденина и культивируют на свету при 26±1^oС при 16-часовом фотопериоде.

Пример 1. Влияние различных концентраций макросолей на инициацию каллусообразования из незрелых зародышей кукурузы.

Для изучения влияния макросолей использовались методы математического планирования эксперимента, описанные в монографии В.Н.Максимова (В.Н.Максимов. Многофакторный эксперимент в биологии. М. МГУ, 1980, 280 с.). Эксперименты проводили по плану дробного факторного эксперимента с двумя уровнями шести факторов (ДФЭ 2(6 3)). В качестве анализируемых факторов использовались (NH₄)₂SO₄, KNO₃, CaCl₂•2H₂O, MgSO₄•7H₂O, KH₂PO₄, FeSO₄ при двух уровнях концентраций (табл. 2).

План эксперимента и результаты опытов приведены в табл. 3.

Таким образом, уравнение регрессии, описывающее зависимость показателя интенсивности образования морфогенного каллуса (процент незрелых зародышей, давших начало морфогенному каллусу) (переменная Y) от концентраций минеральных солей имеет вид:
Y 30,56 4,44•x2 3,88•x3 + 5,00•x6 + 3,33•x5 (1),
где х2 концентрация KNO₃, x3 концентрация MgSO₄•7H₂O, x6 концентрация Fe-хелата, х5 концентрация CaCl₂2H₂O. Отрицательное значение коэффициента перед переменной означает, что увеличение концентрации данного компонента снижает интенсивность формирования морфогенного каллуса. Положительный коэффициент перед переменной означает увеличение интенсивности образования морфогенного каллуса при увеличении концентрации соответствующей соли.

Таким образом, интенсивность формирования морфогенного каллуса увеличивается при увеличении концентрации CaCl₂•2H₂O и Fe-xелата, снижается при увеличении концентрации KNO₃ и MgSO₄•7H₂O. Увеличение концентрации KH₂PO₄ и (NH₄)₂SO₄ не приводит к каким-либо изменениям интенсивности каллусообразования.

Приведенное выше уравнение регрессии можно считать адекватной математической моделью процесса, поскольку фактическое значение коэффициента Фишера не превышает его стандартных значений:
Ffact 0,5845<Fst 5% 4,2000
Ffact 0,5845<Fst 1% 7,5000
Пример 2. Оптимизация состава питательной среды на основе данных дробного факторного эксперимента.

Поскольку линейное уравнение (1) адекватно, то можно определить направление градиента функции отклика dY непосредственно по величинам коэффициентов регрессии при линейных членах Bi:
dY B1i + B2j + + Bnl, (2)
где i, j, l единичные векторы в направлении координатных осей.

Движение в найденном направлении градиента должно быть наиболее коротким путем к оптимуму. Для осуществления такого движения необходимо изменять факторы пропорционально полученным для них коэффициентам регрессии с учетом их знака.

Расчет начинается с перехода от кодированных к натуральным переменным. Для этого вычисляют произведения Bi•Li (где Bi коэффициент в уравнении регрессии, Li единица варьирования переменной в нашем случае концентрация соли) для всех факторов (CaCl₂•2H₂O, KH₂PO₄, KNO₃ и MgSO₄•7H₂O), у которых Bi значимо отлично от нуля. Затем выбирают фактор, для которого произведение Bi•Li было наименьшим по абсолютной величине, и находят величины отношений остальных факторов к для выбранного фактора. Полученным таким образом коэффициентам пропорциональности k приписывают знаки, соответствующие знакам Bi каждого фактора (табл. 4).

Последующее планирование сводится к изменению уровней факторов путем одновременного прибавления или вычитания (в зависимости от знака коэффициента регрессии) рассчитанных шагов к исходному уровню.

При выбранном шаге изменений факторов было приготовлено шесть питательных сред с различным содержанием минеральных солей (табл. 4) и изучена частота образования эмбриогенных каллусов на каждой из этих сред, а также на среде Мурасиге и Скуга в качестве стандарта.

Полученные результаты отражены в табл. 5.

Как видно из табл. 5, наилучшей средой для образования эмбриогенного каллуса оказалась среда N 4 по табл. 4. При этом улучшение наблюдалось как по сравнению с исходной средой (N 1 по табл. 3), так и по сравнению со стандартной питательной средой Мурасиге и Скуга. Однофакторный дисперсионный анализ полученных результатов показывает, что указанные различия являются статистически значимыми при Р<0,05 (Ffact 3,0857>Fst5% 2,5000).

Таким образом, приведенные данные показывают, что оптимальной является питательная среда следующего состава (табл. 6).

Пример 3. Исследование частоты образования эмбриогенного каллуса при нижних значениях заявляемого интервала концентраций компонентов.

Исследование проводили при следующем соотношении компонентов (табл. 7).

На этой питательной среде частота образования морфогенного каллуса составляет 28,4% (22,85% на среде Мурасиге и Скуга). Следовательно, полученные данные свидетельствует о том, что при нижних концентрациях заявляемого интервала отмечается увеличение частоты образования морфогенного каллуса.

Пример 4. Исследование частоты образования эмбриогенного каллуса при верхних значениях заявляемого интервала концентраций компонентов питательной среды.

Исследование проводили при следующем соотношении компонентов (табл. 8).

На этой питательной среде частота образования морфогенного каллуса составляет 27,5% (22,85% на среде Мурасиге и Скуга). Следовательно, полученные данные свидетельствуют о том, что при верхних концентрациях заявляемого интервала отмечается увеличение частоты образования морфогенного каллуса. ТТТ1 ТТТ2 ТТТ3

Использование: сельское хозяйство и биотехнология, в частности для микроразмножения кукурузы. Сущность изобретения: питательная среда содержит микро- и макроэлементы, витамины, регуляторы роста и другие добавки в указанном соотношении и дополнительно аммоний сернокислый в количестве 210 - 240 мг/л среды. 8 табл.

Питательная среда для инициации морфогенного каллуса кукурузы, содержащая КNO₃, СaСl₂•2H₂O, MgSO₄•7Н₂O, КН₂РО₄, Nа₂EDТА•2Н₂O, FeSO₄•7Н₂O, H₃ВО₃, МnSО₄•4Н₂O, ZnSО₄•7Н₂0, Кl, Nа₂МоO₄•2Н₂O, СuSO₄•5Н₂O, СоСl₂•6Н₂O, мезоинозит, никотиновую кислоту, тиамин, пиридоксин, пролин, сахарозу, агар-агар, 2,4-D, циклорам, дикамбу, воду, отличающаяся тем, что она содержит дополнительно (NН₄)₂SO₄ при следующем соотношений компонентов, мг/л среды:
(NH₄)₂SО₄ 210 240
СоСl₂•6Н₂0 0,024 0,026
КNО₃ 280 320
Сахароза 25000 35000
СаСl₂•2H₂O 145 159
Пролин 400 600
МgSO₄•7H₂O 45 50
Мезоинозит 70 130
КH₂РО₄ 100 110
Никотиновая кислота 0,4 0,6
Nа₂ЕDТA•2H₂O 39 41
FeSO₄•7Н₂O 23 31
Пиродоксин HCl 0,9 1,1
H₃ВО₃ 6,0 6,4
Тиамин HCl 0,9 1,1
MnSO₄•4H₂O 22,0 22,5
Агар 7000 8000
ZnSO₄•7Н₂O 8,5 8,7
2,4-D 0,2 0,4
Кl 0,80 0,85
Пиклорам 0,2 0,4
Nа₂MоO₄•2Н₂O 0,24 0,26
Дикамба 0,2 0,4
СuSO₄•5Н₂O 0,024 0,026
Вода До 1 л