Способ получения каллуса кукурузы Советский патент 1991 года по МПК A01H4/00 C12N5/04 

СП

с

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биологическим исследованиям сельскохозяйственных растений методом культуры тканей и клеток, и может быть использовано в работе по созданию новых форм растений, в частности гибридов и исходных форм кукурузы, обладающих хозяйственно ценными признаками. Целью изобретения является повышение выхода змбриогенного каллуса. Способ состоит в том, что незрелые зародыши кукурузы культивируют на питательной среде Мурасиге- Скуга при температуре 29-32°С, при этом в среду дополнительно вносят Дикамбу, Пик- лррам и 2,4-Д, 6 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биологическим исследованиям сельскохозяйственных растений методом культуры клеток и тканей, и может быть использовано в работе по созданию новых форм растений, в частности сортов и исходных форм кукурузы, обладающих хозяйственно ценными признаками.

Целью изобретения является повышение выхода эмбриогенного каллуса.

Способ состоит в том, что эксплантаты культивируют при повышенной температуре (29-32°С) на питательной среде Мурасиге и Скуга, в которую совместно добавляют три ауксина а определенных концентрациях: Дикамбу, Пиклорам и 2,4-Д (по 0,1-0.5 мг/л). При совместном их внесении змбриогенные каллусы образуются со значительно большей частотой, чем когда ауксины добавляются по отдельности.

Способ осуществляется следующим образом.

В качестве эксплантатов используют незрелые зародыши кукурузы сорта Шиндель- майзер, пиний ИК 226-ТВ, А 554, размером 1,5-2,5 мм (15-20 дней после опыления). Незрелые семена поверхностно стерилизуют в 0,1 %-ном растворе сулемы, после промывки из них вычленяют незрелые зародыши и высаживают щитком вверх на среду с минеральными солями по Мурасиге и Скугу (в основном варианте) с 30 г/л сахарозы, 1 мг/л тиамина, 1 мг/л пиродоксина, 1 мг/л никотиновой кислоты, 100 мг/л мезоинози- та, 500 мг/л пролина, 100 мг/л гидролизата казеина 0,8% агара, 0,1-0,5 мг/л 2,4-Д, 0,1- 0,5 мг/л Пиклорама, 0,1-0,5 мг/л Дикамбы, рН среды доводят до 5,8. Культивируют в темноте при 29-32°С в течрние трех недель. Затем сформировавшиеся каллусы пассиру ч о

чэ -ч

ют на свежую питательную среду каждые 2-3 недели. Для регенерации растений сформировавшиеся змбриогенные каллусы переносят на среду с 0,1 мг/л2,4-Д, 0,1 мг/л Дикамбы, 0,1 мг/л Пиклорама, 50 мг/л триптофана, 5 мг/л аденина и культивируют на свету при 26 ±1°С при 16-часовом фотопериоде.

П р и м е р 1. Влияние температуры культивирования на выход эмбриогенного каллуса.

Изучают влияние температуры культивирования незрелых зародышей на выход змбриогенного каллуса кукурузы (линия В- 73). Для этого незрелые зародыши высаживают на среду МС с 1 мг/л 2,4-Д и культивируют: а) при температуре 26 ±1°С; б) при температуре 29 ±1°С; в) при 32 ± 1°С; г) при 35 ± 1°С.

Через 3 недели определяют выход змбриогенного каллуса. Культивирование при температуре 32 ±1°С увеличивает выход змбриогенного каллуса в несколько раз (табл.

1).

Все далее описываемые опыты проводят при температуре 32 ±1°С.

П р и м е р 2. Влияние минеральных солей на выход эмбриогенного каллуса кукурузы.

Для культивирования тканей кукурузы используют самые разнообразные среды. В связи с этим требуется выяснить, какая из наиболее часто употребляемых сред является наилучшей для образования змбриоген- ных каллусов кукурузы из незрелых зародышей. Изучают влияние солей по Му- расиге и Скугу (МС), Гамборга (В5), Чу-Вонга (№6) и Нича на частоту образования эмбри- огенных каллусов из различных генотипов. Результаты отражены в табл. 2.

Эмбриогенные каллусы образуются с самой высокой частотой на среде Мурасиге и Скуга для всех генотипов. В связи с этим все дальнейшие опыты проводят на среде Мурасиге и Скуга.

П р и м е р 3. Влияние фитогормонов на выход эмбриогенного каллуса.

Далее исследуют влияние различных ауксинов (2,4-Д, Пиклорама, Дикамбы) и их комбинаций на образование эмбриогенного каллуса. Для этого готовят среду Мурасиге и Скуга в четырех вариантах: с 1 мл/л Пиклорама (среда П), с 1 мг/л 2,4-Д (среда Д), с 1 мг/л Дикамбы (среда Ди), и в четвертую среду вносят по 0,33 мг/л каждого фи- тогормона (среда ПДДи). Частота образования эмбриогенного каллуса является наиболее высокой на среде ПДДи для всех генотипов (табл. 3).

На других средах частота образования змбриогенного каллуса различная для разных генотипов, причем характер действия фитогормонов различается для каждого генотипа. Так, для сорта Шиндельмайзер среды по способности образовывать эмбриогенный каллус можно расположить в

ряд: ПДДи Д П Ди, для линии А 554: ПДДи Ди П Д, а для линии В 73: ПДДи П Ди Д. Таким образом, обнаружен факт стимуляции образования эмбриогенного каллуса при совместном внесении в

среду культивирования трех фитогормонов: Пиклорама, 2,4-Д и Дикамбы.

П р и м е р 4. Подбор оптимальной концентрации фитогормонов для образования эмбриогенного каллуса кукурузы.

Далее требуется выяснить, какая концентрация фитогормонов является оптимальной для каллусообразования. Для этого в среду МС вносят Пиклорам, 2,4-Д, Дикам- бу в следующих концентрациях: по 0,1 мг/л каждого фитогормона (среда 0,1 ПДДи), по

0,3 мг/л каждого фитогормона (среда 0,3 ПДДи), по 0,5 мг/л каждого ауксина (среда 0,5 ПДДи), по 1 мг/л (1 ПДДи) и по 2 мг/л каждого фитогормона (среда 2 ПДДи). В качестве контроля используют среду МС с 1

мг/л 2,4-Д (среда Д). Частота образования эмбриогенных каллусов является максимальной (генотип - линия А 554) на среде 0,3 ПДДи, на средах 0,1-ПДДи и 0,5 ПДДи превышает контроль, а на средах 1 ПДДи и 2

ПДДи ниже, чем в контроле (табл. 4).

Таким образом, оптимум наблюдается при добавлении 0,3 мг/л каждого фитогормона. Граничными концентрациями предлагаемого способа будут концентрации

каждого фитогормона в 0,1-0,5 мг/л, поскольку при этих концентрациях выход эмбриогенного каллуса выше, чем в контроле.

П р и м е р 5. Регенерация растений из эмбриогенных каллусов кукурузы.

Для регенерации растений эмбриоген- ные каллусу кукурузы переносят на среду МС с 0,1 мг/л Пиклорама, 0,1 мг/л 2,4-Д, 0,1 мг/л Дикамбы, 50 мг/л триптофана, 5 мл/л аденина и далее их культивируют на свету

при 26 ±1°С при 16-часовом фотопериоде. Через две недели наблюдают регенерацию побегов. Определяют процент каллусов с регенерацией и количество побегов на каллус (табл. 5).

Таким образом, из эмбриогенных каллусов, полученных предлагаемым способом, возможна регенерация растений с высокой частотой.

Приведенные данные показывают, что использование способа позволяет увеличить выход эмбриогенного каллуса до 90% (34% в прототипе), причем эффект увеличения выхода наблюдается у различных генотипов.

Перечень компонентов среды, использовавшихся в осуществлении предлагаемого способа.

Состав питательной среды, мг/л: NhUN031650

KN031900

CaCfc -2H20440

MgSO4 -7HaO370

КН2Р04170

N32EDTA -2Н2037.3

FeS04 -7Н2027,8

6,2

4Н2022.3

7Н208.6

0,83

0.26 0,025

НзВОз

MnSCU

ZnS04

KJ

Na2Mo04 2H20

CuS04 -5H20

Влияние температуры культивирования на выход эмбриогенного каллуса

Влияние минеральных солей на процент формирования эмбриогенного каллуса из незрелых зародышей для разных генотипов

Влияние фитогормонов на процент образования эмбриогенного каллуса из незрелых зародышей для разных генотипов

CoCl2 -6H200.025

Сахароза30000

Пролин500

Мезоинозит100,0

Никотиновая кислота0,5

Пиридоксин HCI1,0

Тиамин НСГ1,0

Агар7000

рН5,8

Гормоны(табл. 6)

Формула изобретения

Способ получения каллуса кукурузы, включающий эксплантацию незрелых зароды шея на модифицированную питательную среду Мурасиге-Скуга и последующее куль- тивирование,отличающийся тем,что. с целью повышения выхода эмбриогенного каллуса, зародыши эксплантируют на питательную среду, дополнительно содержащую 0,1-0,5 мг/л натриевой соли дихлорфени- луксусной кислоты, 0.1-0,5 мг/л Пиклорама и 0,1-0,5 мг/л Дикамбы, и культивирование проводят при 29-32°С.

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

Влияние концентраций фитогормонов на выход эмбриогенного каллуса кукурузы линии А 554

Таблица 5 Регенерация растений из полученного по данному способу эмбриогенного каллуса

Гормоны, необходимые для осуществления способа

Таблица А

Таблица 6