СРЕДА ДЛЯ ИНДУКЦИИ КАЛЛУСОГЕНЕЗА ИЗ НЕЗРЕЛЫХ ЗАРОДЫШЕЙ ЯЧМЕНЯ Российский патент 1998 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к биотехнологии и физиологии растений и может быть использовано для получения растений-регенерантов ячменя.

Известно культивирование незрелых зародышей ячменя на среде СС /1/. Однако выход регенерантов зависит от сорта ячменя.

Наиболее близкой из известных, принятой за прототип является среда MT, содержащая KNO₃, MgSO₄ • 7H₂O, CaCl₂ • 2H₂O, KH₂PO₄, (NH₄)₂SO₄, H₃ВО₃, MnSO₄ • 4Н₂O, ZNSO₄ • 7Н₂O, Na₂MoO₄ • 2H₂O, CuSO₄ • 5H₂O, CoCl • 6H₂O, KJ, Na₂ЭДТА, FeSO₄ • 7H₂O, глицин, тиамин хлорид, пиридокоин HCl, никотиновую кислоту, аспарагин, глутамин, мезоинозит, дрожжевой экстракт, AgNO₃, сахарозу, 2,4,5Т, агар /2/.

Однако использование этой среды не позволяет получать растения-регенеранты с высокой частотой у любых сортов ячменя.

Предлагаемое изобретение направлено на увеличение частоты образования эмбриогенных каллусов и растений-регенерантов у любых сортов ячменя. Для этой цели незрелые зародыши ячменя длиной 1 1,5 мм с прозрачным щитком культивируют на среде следующего состава: H₃ВО₃, MnSO₄ • 4Н₂O, ZNSO₄ • 7Н₂O, Na₂MoO₄ • 2H₂O, CuSO₄ • 5H₂O, CoCl • 6H₂O, KJ, Na₂ЭДТА, FeSO₄ • 7H₂O, глицин, тиамин хлорид, пиридоксин HCl, никотиновая кислота, аспарагин, глутамин, мезоинозит, дрожжевой экстракт, AgNO₃, 2,4,5Т, мальтоза, культуральная жидкость Bipolaris sorokiniana, агар.

Технология приготовления среды. Готовят концентрат макросолей, при этом каждую из макросолей растворяют отдельно в небольшом количестве воды, а затем объем доводят до 1 л. Аналогично готовят концентрат микросолей и витаминов. Для приготовления 1 л питательной среды берут следующие соли, мг/л (табл. 1).

Пример 1. Макро- и микросоли, а также витамины в виде концентратов вносят в 0,5 л дистиллированной воды и добавляют аспарагин, глутамин, мезоинозит, дрожжевой экстракт, культуральную жидкость, мальтозу, агар тщательно перемешивают и раствор доводят до 1 л дистиллированной водой. Среду разливают в литровые колбы по 0,5 л в каждую, закрывают ватно-марлевой пробкой под пергамент и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 0,8 атм. После автоклавирования добавляют 2,4,5Т в виде концентрированного раствора в этаноле и водный раствор AgNO₃.

Для получения культуральной жидкости токсигенный штамм В. sorokiniana культивируют в темноте при 26^oC в среде, содержащей: тартрат аммония 5 г/л, NH₄NO₃ 1 г/л, KH₂PO₄ 1 г/л, MnSO₄ 0,5 г/л, NaCl 0,1 г/л, CaCl₂ 0,13 г/л, MnSO₄ 1 мг/л, дрожжевой экстракт 1 г/л, микроэлементы 1 мл, глюкоза 30 г/л в колбах по 200 мл среды. Через 28 дней мицелий гриба удаляли фильтрованием. Культуральную жидкость подвергали лиофильной сушке и субстрат растворяли в 1/10 объема дистиллированной воды от исходной культуральной жидкости; полученный раствор обозначают КЖх10.

Среду для культивирования незрелых зародышей хранят при комнатной температуре в темноте.

Пример 2. Из выращенных в теплице растений ячменя семена стерилизуют в диоциде 20 мин и трижды промывают стерильной водой. В ламинаре извлекают зародыши длиной 1 1,5 мм и помещают на поверхность среды щитком вверх по 10 зародышей на чашку Петри. Чашки помещают в термостат при t 25^oC. Через 30 дней учитывают мягких, прозрачных, липких неэмбриогенных каллусов и плотных структурированных, желтых эмбриогенных каллусов. Результаты оценки заносят в таблицу. Частота образования эмбриогенных каллусов на среде NMT составляет 0 68,7% на среде ЛТ 59 100% в зависимости от генотипа сорта /табл. 2/. Таким образом, использование предлагаемой среды увеличивает частоту образования эмбриогенных каллусов до 60 100% и соответственно выход растений-регенерантов до 90 100% от числа эмбриогенных каллусов /табл. 3/.

Использование: сельское хозяйство и биотехнология. Сущность изобретения: среда для индукции каллусогенеза из незрелых зародышей ячменя содержит KNO₃, MgSO₄•7H₂O, CaCl₂•2H₂O, KH₂PO₄, /NH₄/₂SO₄, H₃BO₃, MnSO₄ • 4H₂O, ZnSO₄•7H₂O, Na₂MoO₄ • 2H₂O, CuSO₄•5H₂O, CoCl₂ • 6H₂O, KJ, Na₂ЭДТА, FeSO₄•7H₂O, глицин, тиамин хлорид, пиридоксин HCL, никотиновую кислоту, аспарагин, глутамин, мезоинозит, дрожжевой экстракт, AgNO₃, источник углерода, 2,4,5Т, агар и воду и дополнительно содержит мальтозу и культуральную жидкость Bipolaris sorokiniana при указанных соотношениях компонентов. 3 табл.

Среда для индукции каллусогенеза из незрелых зародышей ячменя, содержащая KNO₃, MgSO₄ • 7H₂O, CaCl₂ • 2H₂O, KH₂PO₄, (NH₄)₂SO₄, H₃BO₃, MnSO₄ • 4H₂O, ZnSO₄ • 7H₂O, Na₂MoO₄ • 2H₂O, CuSO₄ • 5H₂O, CoCl₂ • 6H₂O, KJ, Na₂ ЭДТА, FeSO₄ • 7H₂O, глицин, тиамин хлорид, пиридоксин HCl, никотиновую кислоту, аспарагин, глутамин, мезоинозит, дрожжевой экстракт, AgNO₃, источник углерода, 2,4,5Т, агар и воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит мальтозу и культуральную жидкость Bipolaris sorokiniana при следующих соотношениях компонентов, мг/л воды:
KNO₃ 2490 3040
MgSO₄ • 7H₂O 130 201
CaCl₂ • 2H₂O 102 185
KH₂PO₄ 380 430
(NH₄)₂SO₄ 402 500
H₃BO₃ 4,3 7,4
MnSO₄ • 4H₂O 1,56 2,67
ZnSO₄ • 4H₂O 6,0 10,3
Na₂MoO₄ • 2H₂O 0,17 0,3
CuSO₄ • 5H₂O 0,02 0,03
CoCl₂ • 6H₂O 0,02 0,03
KJ 0,57 0,99
FeSO₄ • 7H₂O 19,4 33,3
Na₂ЭДТА 26,1 44,7
Глицин 1,9 2,1
Тиамин хлорид 0,9 1,1
Пиридоксин HCl 0,4 0,55
Никотиновая кислота 0,40 0,55
Аспарагин 230 260
Глутамин 230 260
Мезоинозит 100 500
Дрожжевой экстракт 100 500
AgNO₃ 8,0 15,0
Мальтоза 23000 30000
2,4,5Т 1,5 3,0
Культуральная жидкость Bipolaris sorokiniana, мл/л 3,5 6,0
Агар-агар 7000 9000
Дистиллированная вода До 1 ло