Способ получения растений-регенерантов кукурузы из культуры тканей Советский патент 1988 года по МПК C12N5/00 A01H5/10 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к биологическим исследованиям сельскохозяйственных растений методом культуры изолированных тканей, и может быть использовано в .работе по созданию новых форм растений, в частности сортов и линий кукурузы, обладающих хозяйственно ценными признаками,.

Низкий выход регенерантрв растений в культуре тканей злаковых является одним из лимитирующих факторов для применения клеточных технологий в процессах создания новых сортов растений с хозяйственно ценными признаками..

Целью изобретения является повышение выхода растений-регенерантов и увеличение их жизнеспособности.

Способ заключается в том, что при культивировании растений кукурузы в культуре тканей, включающем культивирование эксплантатов на питательной среде, субкультивирование первичных каллусов, отбор морфоген- ных каллусов и получение в дальнейшем растений-регенерантов,в среду для регенерации растений и в- среду для укрепления сформировавшихся по- бегов добавляют предшественники фи- тогормонов - -триптофан (предшественник ауксина) и аде-нин (предшественник цитокинина) в определенном соотношении. При этом наличие в среде предшественников фитогормонов позволяет смещать направленность синтеза эндогенных фитогормонов и дает возможность более тонко регулировать морфогенетические процессы в каллу- сах сообразно физиологическим особенностям каждого генотипа.

Способ осуществляется следующим

способом..

Незрелые зародыши (15-20 дн после опьшення) гибридов кукурузы поверхностно стерилизуют в 2%-ном растворе хлорамина в течение 20 мин, трижды промывают в стерильной дистиллированной воде и помещают на среду N6 Чу-Вонга, содержащую 1 мг/л тиамина, 3% сахарозы, 1% агара, 1 мл/л 2,4-ди хлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д), щитком вверх и культивируют при 32±

±1 С в темноте в течение 2-3 недель. Образовавшиеся каллусы пассируют на свежую питательную среду .каждьй 2-3 недели.

0

5 Q Q

е

5

0

5

Через 2-3 пассажа среди каллусов отбирают морфогенные двух типов: желтые, плотные, развивающиеся из зародышевой оси, или белые, блестящие, плотные, развивающиеся из тканей щитка.

Отобранные каллусы переносят на среду регенерации N6, содержащую 1 мг/л тиамина, 3% сахарозы, 7, агара, 40-60 мг/л триптофана, 1-9 мг/л аденина, 0,1-0,3 мг/л 2,4-Д, и культивируют на свету при при 16-часовом фотопериоде.

Через 1-2 недели образовавшиеся побеги переносят на среду N6, содержащую 1 мг/л тиамина, 3% сахарозы, 1% агара, 10-30 мг/л триптофана и 1-20 мг/л аденина, для укрепления сформировавшихся побегов и культивируют при 16-часовом фотопераоде при 27±ГС.

Через неделю укрепившиеся побеги высаживают на среду для укоренения, содержащую половинную концентрацию солей по N6 и 1% сахарозы, 1% агара, и выдерживают на ней в течение недели при и 16-часовом фото- периоде. Укоренившиеся побеги пересиживают в почву и культивируют до стадии зрелости.

Получение морфогенньЬс каллусов кукурузы (общее для всех случаев). Незрелые зародьгащ 15-20 дн после опьшения гибридов кукурузы Днепровский 247, Р-927, н.5166 и инбрёдной линии 0,5445 поверхностно 1 Стерилизуют в 2%-ном растворе хлорамина в течение 20 мин, трижды промывают в стерильной дистиллированной воде и помещают на среду Ntj Чу-Вонга, содержащую 1 мг/л тиамина, 3% сахарозы, 1% агара, 1 мг/л 2,4-Д, щитком вверх и культивируют при 32±l c в темноте в течейие 2-3 недель. Образовавшиеся каллусы пассируют на свежую питательную среду каждые 2-3 недели.

Через 2-3 пассажа среди каллусов отбирают морфогениые двух типов: желтые, плотные, развивакщиеся из тканей зародышевой оси, или белые, блестящие, плотные, развивающиеся из тканей щитка. Отобранные каллусы переносят на среду регенерации.

Пример 1. Полученные морфо- генные каллусы пересаживают на среду регенерации N6, содержащую 1 мг/л тиамина, 3% сахарозы, 17, агара, 40 мг/л триптофана, 1 мг/л аденина.

0,1 мг/л 2,4-Д, и культивируют на свету при 27±1°С при 16-часовом фотопериоде.

Через 1-2 недели формируются листовые зачатки, побеги на некоторых морфогенных каллусах. Частота образования регенерантов зависит от генотипа исходного растения.

IIpoueH i регенерации растений Для различных генотипов кукурузы на среде N6 с 40 мг/л триптофана, 1 мг/л аденина. О,1 мг/л 2,4-Д приведен в табл. 1.

Таким образом, осуществление способа возможно при использовании в среде регенерации 40 мг/л, триптофана, 1 мг/л аденина и 0,1 мг/л 2,4-Д (нижняя граница заявленного интервала концентраций компонентов).

Прим ер 2. Мо рфогенные каллусы пересаживают на среду N6, содержащую 1 мг/л тиамина, 3% сахарозы 1% агара, 50 мг/4т триптофана, 5 мг/л аденина 0,2 мг/л 2,4-Д, и культиви- РУ1ЭТ на свету при 27±1 С при 16-часовом фотопериоде.

Че рез 1-2 недели наблюдается формирование зачатков побегов, причем со значительно большей частотой, чем на среде регенерации (пример I). Частота регенерационных событий также зависит от генотипа растений доноров эксплантатов.

Процент регенерации растений для ра: личных генотипов на среде N6 с 50 мг/л триптофана, 5 мг/л аденина и 0,2 мг/л 2,4-Д приведен в табл.2.

Таким образом, осуществление способа возможно при использовании в среде регенерации 50 мг/л триптофа- на, 5 мг/л аденина, 0,2 мг/л 2,4-Д наилучшим образом, с наивысшей частотой регенерации (оптимальные концентрации компонентов).

П р и м е р 3. Морфогенные кал/1у- сы пересаживают на среду регенерации N6, содержащую 1 мг/л тиамина, 3% сахарозы, 1% агара, 60 мг/л триптофана, 9 мг/л аденина и 0,3 мг/л 2,4-Д, и культивируют на свету при и 16-часовом фотопериоде.

Частота формирования зачатков побегов, образующихся через 1-2 недели снижается для всех тестированных генотипов по сравнению с вариантом с оптимальными значениями концентраций компонентов. Осуществление способа

0

5

0

получения растений-регенерантов из каллусов возможно при концентрации в среде регенерации N6 триптофана 60 мг/л, аденина 9 мг/л, 2,4-Д 0,3 мг/л (верхняя граница заявленного интервала концентраций компонентов).

Процент регенерации растений для различных генотипов на среде N6 с 60 мг/л триптофана, 9 мг/л аденина и 0,3 мг/л 2,4-Д приведен в табл. 3.

II р и м е р 4. Изучают влияние различных концентраций триптофана и аденина на регенерацию растений в культуре каллусов. Концентрацию триптофана в среде N6 меняют от 20 до 80 мг/л, аденина от О до 10 мг/л, концентрация 2,4-Д фиксируется на уровне 0,2 мг./л.

При этом показано (табл. 4), что использование триптофана в концент- раиди ниже 40 мг/л и выше 60 мг/л, аденина ниже I мг/л и выше 9 мг/л не приводит к желаемому эффекту - регенерации растений.

Данные сведены в табл. 4.

Пример 5. Зачатки побегов, сформировавшихся на среде регене-. рации, переносят на среду N6 для укрепления побегов, содержащую 1 мг/л тиамина, 3% сахарозы, 1% агара, 10-30 мг/л триптофана, 1-20 мг/л аденина и культивируют на свету при 16-часовом фотопериоде при .

При использова ши среды для укрепления побегов с добавлением триптоQ фана и аденина в указанных интервалах концентраций наблюдается более быстрый рост растений, увеличивается их высота и диаметр,и, таким образом, повьшается жизнеспособность регенеg рантов.

Влияние триптофана и аденина в среде для укрепления побегов на жизнеспособность растений-регенерантов. п оказано в табл. 5.

5

0

5

50

55

Примерб. Изучают влияние различных концентраций триптофана и аденина в среде для укрепления побегов на увеличение жизнеспособности регенерантов. Уровни триптофана меняют от О до 40 мг/л, уровни аденина - от О до 30 мг/л.

Результаты исследований приведен в табл. 6.

Из табл. 6 видно, что при использовании концентраций триптофана выше 30 мг/л и аденина выше 20 мг/л наблюдается некоторое угнетение роста побегов. При концентрациях трий- тофана 10 мг/л и аденина ниже 1 мг/л нет заметного увеличения жизнеспособности регенерантов. .

Через неделю культивирования на среде для укрепления побегов регене- ранты пересаживают на среду для укоренения, содержащую половинную концентрацию солей по N6, 1% сахарозы, 1% агара, и вьщерживают на ней в течение недели при 27il°C и 16-часовом фотопериоде. Укоренившиеся побеги переносят в почву и культивируют до стадии зрелости.

Таблица

Генотип

I

Побегообразование, %

Генотип

Таблица2

Побегообразование, %

Изобретение относится к биотех- иологии, а именно к культивированию тканей растений, и может быть использовано в селекционной работе. Целью изобретения являет.ся увеличение выхода растений-регенерантрв из культуры тканей, а также повыпение их жизнеспособности, что достигается добавлением в среду для регенерации, и в среду для укрепления побегов предшественников мтогормонов - триптофана и аденина. 6 табл.

Формула изобретения

Способ получения растений-регене- рантов кукурузы из культуры тканей, включающий культивирование первичных эксплантатов на питательной среде N6 Чу Вонга, субкультивирование первичных каллусов, отбор морфогенных каллусов и получение из них регенерантов, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода растений-регенерантов и увеличения их жизнеспособности, в питательную среду для регенерации добавляют триптофан в концентрации 40-60 мг/л, аденин в концентрации 1-9 мг/л и 2,4-Д в концентрации 0,1-0,3 мг/л, а в среду для укрепления побегов добавляют, триптофан в концентрации 10-30 мг/л и аденин в концентрации 1-20 мг/л.

Компоненты среды. Регенерация, % для гено- мг/лтипа

5 0

О

О О

о

5,2

Гибрцды

Днепровский 247

Р-927 н5166

Инбредная линия 05445

58,3 12,3

ia,5

Таблица 3

30

Генотип

Побегообразование, %

Гибриды

Днепровский 247 Р-927 Н5166

Инбредная линия 05445

9,3 2,2 2,5

1,5

Таблица 4

О

О

о о

(

12,3

О О О

о

58,3

5 10

10 0,6-1,0 1,0-1,6 1 1,0-1,5 1,2-1,7

30 30 40 30 40

10 20 10 30 30

Составитель В. Демкин Редактор И. Гунько Техред М.Моргентал Корректор Г. Решетник

Заказ 7566

Тираж 520

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

3,0 2,0 1,1 0, 8 0,8

2,5-3,5 ,6 1,2-1,5 1,1-1,3, 1,0-1,4

Подписное