Способ регенерации растений пшеницы в культуре тканей Советский патент 1991 года по МПК C12N5/04 A01H4/00 

&

Ё

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биотехнологическим исследованиям растений методом культуры клеток и тканей, и может быть использовано в работе по созданию новых форм растений, в частности сортов и исходных форм пшеницы, обладающих хозяйственно ценными признаками. Целью изобретения является повышение выхода регенерантов и их жизнеспособности. Способ предусматривает получение из основания листа каллуса с последующей регенерацией, при этом в процессе культивирования ступенчато изменяют концентрации фитогормонов и освещенность. 8 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биологическим исследованиям сельскохозяйственных растений методом культуры клеток и тканей, и может быть использовано в работе по созданию новых форм растений, в частности сортов и исходных форм пшеницы, обладающих хозяйственно ценными признаками.

Целью изобретения является повышение выхода регенерантов и их жизнеспособности.

Способ предусматривает получение каллуса из экспланта, индукцию образования морфогенного каллуса, регенерацию растений и укоренение с использованием питательных сред на основе среды Мурасиге- Скуга, в качестве экспланта используют основание листа, а концентрацию фитогормо- нов и интенсивность света изменяют ступенчато: перед высадкой на регенерационную среду каллусы, индуцированные при высоких

(2-4 мг/л) концентрациях 2,4-Д, постепенно адаптируют ко все более низким концентрациям этого гормона (от 2 до 0,1 мг/л) и условиям освещения (темнота - 500-1000 лк), затем в регенерационной среде ступенчато увеличивают содержание зеатина (от 0,1 до 2 мг/л) при постоянной концентрации ИУК (0,01 мг/л) и повышают интенсивность света от 1000 до 2000 лк;для укоренения и повышения жизнеспособности растений ступенчато изменяют в среде для укоренения содержание ИУК от 0,1 до 0.5 мг/л, увеличивают освещенность до 4000 лк. Перед высадкой в почву растения выдерживают в среде с половинным содержанием солей по Мурасиге-Скугу (МС) и повышенной по сравнению с регенерационной средой концентрацией ИУК - 0,1-0,5 мг/л. Этим достигается стимуляция развития корневой системы, повышение жизнеспособности регенерантов, позволяющие предотвратить

XI

О

xl

Ь.

4

или уменьшить трансплантационный шок, обусловленный переносом растений из условий In vitro (пробирки) в In vivo (почву). Разработанный способ дает возможность более тонко регулировать морфогенетиче- ские реакции и адаптационные потенции культуры клеток и тем самым регенерировать растения из считающихся низкототи- потентными тканей листа пшеницы.

Способ осуществляется следующим образом.

Зерновки озимой мягкой пшеницы ( Тг, aestlvum сорт Прогресс) поверхностно стерилизуют последовательно в растворах диацида, этанола, трижды отмывают стерильной дистиллированной водой, и помещают на твердую солевую среду по МС и проращивают на свету 2000hOO лк при температуре 25+1 °С,через 7-8 дней из проростков вычленяют стерильно базальную часть листа. Сегменты из основания листа длиной 3-5 мм помещают на твердую питательную среду для каллусогенеза, содержащую соли по МС, 100 мг/л мезоинозита, 2 мг/л глицина, 0,5 мг/л никотиновой кислоты, 0,5 мг/л пиридоксина, 1 мг/л тиамина, 3% сахарозы, 0,7% агара, 2,4-Д при рН 5,7. Экспланты культивируют при 2515,5°С и относительной влажности воздуха 60-70%. Образовавшиеся каллусы переносят на свежую питательную среду того же состава и культивируют 2-3 недели до образования колоний со средним диаметром 8-10 мм. Далее последовательно осуществляют следующие этапы:

а)перенос каллусов на среду того же состава, но с содержанием 1 мг/л 2,4-Д, культивирование 12-14 дней в темноте при 25tO,5°C;

б)пересадка каллусов на ту же среду с 0,7 мг/л 2,4-Д, культивирование 12- 14 дней при освещенности 500±100 лк и 25iO,5°C;

в)пересадка каллусов на среду с 0,5 мг/л 2,4-Д, культивирование 12-14 дней при освещенности 500+100 лк и 25+0,5°С;

г)пересадка каллусов на среду с 0,3 мг/л 2,4-Д, культивирование 12-14 дней при 10001100 лк и 25±0,5°С;

д)пересадка каллусов на среду с 0,1 мг/л 2,4-Д, культивирование 12-14 дней при 1000+100 лк и 25±0.5°С.

Этап культивирования каллусов при концентрации 0,1 мг/л 2,4-Д существенного влияния на морфогенетическую активность ткани не оказывает и в целях ускорения регенерации его можно не проводить.

Указанная выше процедура последовательного переноса каллуса на среды со все более понижающимися концентрациями 2,4-Д позволяет избежать некроза каллусу,

наблюдаемого при прямом его переносе со среды для каллусогенеза на регенерацион- ную, а также существенно увеличить выход эмбриогенного каллуса (примеры).

Далее эмбриогенные каллусы, характеризующиеся плотной зарнистой консистенцией, желтовато-зеленого цвета с четко выделяемыми участками из слабовакуоли- зированных клеток меристемоидного типа

0 переносят на регегерационную среду. Последовательно проводят следующие операции:

а)перенос эмбриогенных каллусов на среду, содержащую соли по МС, 100 мг/л

5 мезоинозита, 2 мг/л глицина, 0,5 мг/л никотиновой кислоты, 0,5 мг/л пиридоксина, 1 мг/л тиамина, 3% сахарозы, 0,7% агара. Концентрация фитогормонов - 0,5 мг/л зеа- тина, 0,01 мг/л ИУК, Культивируют 7-8 дней

0 при 1000 лк, 27i1°C;

б)пересадка на среду гого же состава, но концентрацию зеатина увеличивают до 1 мг/л. Интенсивность света повышают до 2000 лк, культивируют 7-8 дней;

5в) пересадка на ту же среду и культивирование при тех же условиях, но концентрацию зеатина повышают до 2 мг/л.

Использование этапов культивирования с концентрациями зеатина ниже 0.5

0 мг/л существенного влияния нэ регенера- ционную активность не оказывает, и эти этапы можно не осуществлять.

Образовавшиеся на регенерационной среде побеги переносят на среду для

5 укоренения, содержащую половинную концентрацию солей по МС и различные концентрации ИУК. В этих условиях регене- ранты переходят постепенно на фотротроф- ный способ питания (так как среда не

0 содержит органических добавок). Последовательно осуществляют следующие этапы:

а)перенос побегов на половинную минеральную среду МС с содержанием 0,3 мг/л ИУК, освещенность 2000 лк при 16-ча5 совом фотопериоде, температура 27± 1°С, культивирование 5-6 дней;

б)культивирование побегов в тех же условиях, но концентрацию ИУК увеличивают до 0,5 мг/л;

0в) перенос растений на ту же минеральную среду, увеличивают концентрацию ИУК до 1 мг/л и интенсивность света до 4000 лк.

Культивирование побегов на средах с концентрациями ИУК ниже 0,3 мг/л суще- 5 ственного влияния на жизнеспособнсоть регенерантов не оказывает, а при концентрациях выше 1,0 мг/л процент укоренившихся растений снижается.

Растения-регенеранты с хорошо развитой корневой системой высаживают в почву

и осуществляют полный этап вегетации до получения семян.

Полученные из листовой ткани расте- ний-регенеранты. проходят селекционно-генетические испытания в полевых условиях. Среди них выявлены i сомаклональные варианты с хозяйственно-ценными признаками.

П р и м е р 1. Изучают влияние различных концентраций 2,4-Д на морфогенетиче- скую активность каллусной ткани. Каллусы индуцируют на среде с 2-4 мг/л 2,4-Д. Выход морфогенных каллусов на этой среде 1-2 %. Данные приведены в табл.1,

41 р и м е р 2. Изучают влияние различ- ных этапов субкультивирования при последовательно понижающихся концентрациях 2,4-Д. Данные приведены в табл.2.

Как видно из сравнительного анализа данных табл.1 и 2, при ступенчатом пониже- нии концентрации 2,4-Д в среде культивирования процент морфогенных каллусов существенно возрастает (до 64%). При концентрациях 2,4-Д ниже 0,3 мг/л дальнейшего усиления эффекта ступенчатого изменения градиента воздействия не наблюдается.

ПримерЗ Изучают влияние условий предварительного субкультивирования каллусов при различных концентрациях 2,4-Д на появление некротических участков в кал- лусах при их пересадке на регенерацион- ную среду. В этом же опыте оценивают частоту регенерации. Данные приведены в табл.3.

П р и м е р 4, Изучают влияние различ- ных концентраций фитогормонов в регене- рационной среде на частоту появления побегов. Морфогенные каллусы получают путем ступенчатого снижения концентрации 2,4-Д от 4 до 0,3 мг/л. Данные приведе- ны в табл.4.

Как видно из приведенных данных, оп- тимальныне для регенерации растений концентрации при прямой пересадке составляют 1,0-2,0 мг/л. Дальнейшее повы- шение концентации снижает эффект.

П р и м е р 5, Изучают влияние ступенчатого изменения концентрации зеатина на регенерационную способность каллусов. Морфогенные каллусы получают, как в при- мере 4. Концентрация ИУК постоянна и равна 0,01 мг/л. Данные приведены в табл.5.

Из сравнительного анализа данных табл.4 и 5 следует следующее: при ступен- чатом повышении концентрации зеа/ина частота регенерации возрастает по сравнению с прямой пересадкой. Кроме того, возрастает также в 1,5 раза количество побегов с одного каллуса.

Примерб, Изучают влияние различных концентраций ИУК в среде для укоренения на жизнеспособность растений-регенерантов, оцениваемую по количеству укоренившихся в почве растений. Данные приведены в табл.6.

Как видно из приведенных данных, оптимальные для укоренения растений концентрации ИУК находятся в пределах 0,3-1,0 мг/л. Ступенчатое изменение концентрации ИУК дает 100%-ную приживаемость, при этом корневая система растений более мощная, чем при прямой пересадке на среду с 0,5 мг/л ИУК.

Пример. Изучают влияние освещенности на частоту образования морфогенных каллусов. Условия индукции каллусогенеза, как в примере 1. Данные приведены в табл,7.

Из данных следует, что освещение каллусов в 1,5 раза увеличивает частоту появления морфогенных каллусов.

Перечень компонентов среды, использовавшихся в осуществлении предлагаемого способа,

Состав питательной среды, мг/л МН4МОз1650

КМОз1900

CaCl2 2Н20440

MgS04 7H20370

КНаР04170

N32EDTA 2Н2037,3

FeS04 7Н2027,8

НзВОз6,2

MnSCM 4H2022,3

ZnS04 7H208,6

KI0,83

Na2Mob4 2H200,25

CuSCM 5Н2О0,025

CoCI2 6Н200,025

Сахароза30000

Глицин2,0

Мезоинозит100,0

Никотиновая кислота0,5

Пиридоксин HCI1,0

Тиамин HCI1,0

Агар7000

РН5,7

Гормоны (табл.8) Формула изобретения Способ регенерации растений пшеницы в культуре тканей, включающий получение первичного каллуса из экспланта, индукцию образования и культивирование эмбриогенного каллуса, получение регене- рантов и их укоренение с использованием питательных сред на основе Мурасиге-Ску- га в присутствии фитогормонов.о т л и ч а ю- щ и и с я тем,что с целью повышения выхода регенерантов и их жизнеспособности, в качестве экспланта используют основание листа, при культивировании эмбриогенного каллуса в питательной среде изменяют ступенчато концентрацию 2,4-Д от 2 до 0,1 мг/л и освещенность от 500 до 1000 лк, при получении регенёрэнтов в среде ступенчато изменяют концентрацию зеатина от 0,1 до

Влияние различных концентраций 2,4 - Д на морфогенез

Исследование различных ступенчатых изменений содержания 2.4 - Д

Влияние изменения содержания фитогормонов на регенерацию

2 мг/л, устанавливают концентрацию индо- лил-3-уксусной кислоты, равную 0,01 мг/л, и освещенность увеличивают от 1000 до 2000 лк, при укоренении регенерантов в среде ступенчато изменяют концентрацию индо- лил-3-уксусной кислоты от 0,1 до 0,5 мг/л и освещенность от 2000 до 4000 лк.

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

Влияние содержания фитогормонов на побегообразование

Влияние изменения содержания зеатина на регенерационную способность

Влияние содержания ПУК на укоренение

Таблица 4

Таблица 5

Таблица б

Влияние освещенности на морфогенез

Содержание фитогормонов в различных средах

Таблица 7

Таблица 8