СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА "ЛИЗОСПОРИН", ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ДЕЙСТВИЕМ НА ПНЕВМОТРОПНЫЕ БАКТЕРИИ Российский патент 2004 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 A61P31/04 

Изобретение относится к области медицины, а именно к бактерийным препаратам - пробиотикам, и может быть использовано для коррекции микроэкологических нарушений в бронхиальном дереве с помощью аэрозольного способа введения при хроническом бронхите и хроническом обструктивном бронхите.

Известен иммуностимулирующий препарат микробного происхождения "Бронхо-Ваксом", содержащий экстракт из 8 видов бактерий - возбудителей инфекций дыхательных путей [1, 3].

Недостатком этого препарата является отсутствие прямой антибактериальной активности.

Известен иммуномодулятор микробного происхождения "Рибомунил", содержащий органоиды и фрагменты клеточных оболочек 5 видов бактерий - возбудителей инфекций дыхательных путей [2, 3].

Недостатком этого препарата является отсутствие прямой антибактериальной активности.

Близким к заявляемому изобретению является препарат ИРС 19, содержащий бактериальные лизаты 19 бактерий - возбудителей заболеваний органов дыхания [4].

Недостатком данного препарата является отсутствие непосредственного антагонистического действия на аллохтонную микрофлору органов дыхания.

В качестве прототипа заявляемого изобретения выбран фармакопейный пробиотик "Биоспорин", содержащий живые культуры Bacillus subtilis и Bacillus licheoifprmis [5].

Недостатком данного препарата является наличие частиц и конгломератов бактериальных клеток, затрудняющих перевод его в аэрозольной состояние с помощью небулайзера (засоряется сопло прибора).

Целью предлагаемого изобретения является разработка способа получения экстракта микробов Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis, обладающего антибактериальным действием на пневмотропные микроорганизмы, пригодного для введения в бронхолегочный аппарат в виде аэрозоля с помощью небулайзера.

Поставленная цель достигается тем, что сначала штаммы-продуценты пробиотика "Биоспорин" (Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis), выращенные на мясо-пептонном агаре в течение 18-24 ч при температуре 37^oС, смывают с поверхности питательной среды дистиллированной водой и доводят ею до концентрации 20 млрд микробных тел (по стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасовича). Затем их смешивают в соотношении 1:3 и проводят термолиз полученной бактериальной суспензии при температуре 65-75^oС в течение 55-65 мин. После этого проводят очистку термолизата от оставшихся бактериальных клеток и клеточного детрита центрифугированием при 3000 об. в 1 мин и фильтрацией через целлюлозный фильтр 3 в стеклянную тару.

Таким образом, из смеси микробов получается прозрачный экстракт, содержащий бактериоцины, свободный от балластных веществ и пригодный для введения в бронхиальное дерево небулайзером.

Для планирования эксперимента по выбору оптимального режима термолиза бактериальных клеток использовали метод оптимизации процесса по схеме ортогональных латинских прямоугольников.

Результирующим признаком выбрали величины зон подавления роста пневмотропных бактерий, выделенных из мокроты больных хроническим обструктивным бронхитом (пневмококка, β-гемолитического стрептококка группы А, эпидермального стафилококка, Pseudomonas putida).

Матрица планирования эксперимента и полученные результаты представлены в табл. 1 и 2.

Согласно данным, приведенным в табл. 2, оптимальным параметром приготовления экстракта следует принять температуру 70^oС при экспозиции 60 мин. Бактериоцинную активность такого образца сравнивали с имевшейся у живых клеток, выращенных по методу "полоски" (контроль 1) и аутолизата биомассы "Биоспорина", полученного при температуре 55^oС в течение 72 ч (контроль 2). Результаты приведены в табл. 3.

Согласно данным, представленным в табл. 3, за исключением испытания стрептококка, полученный по выбранному оптимальному режиму экстракт практически не уступает по бактериоцинной активности обоим контролям ("Биоспорину" и аутолизату его штаммов-продуцентов).

Готовый экстракт представляет собой прозрачную жидкость без осадка, опалесцирующую в проходящем свете светло-желтым цветом (при естественном освещении). Содержит бактериоцины штаммов-продуцентов пробиотика "Биоспорин", белки, минеральные и другие вещества. Состав и данные спектрального анализа приведены в табл. 4 и на чертеже.

Показано, что использование штаммов-продуцентов других пробиотитиков ("Споробактерина", "Бактисубтила") для получения экстракта по предлагаемому нами способу не позволяет получить заявляемого положительного эффекта подавления жизнедеятельности пневмотропных бактерий in vitro. Это демонстрируют данные использования как исходных пробиотиков (табл. 5, 6), так и сравнительные результаты испытаний экстрактов, полученных из штаммов-продуцентов "Биоспорина" (Bacillus subtilis штамм В-2335 и Bacillus licheniformis штамм В-2336), "Споробактерина" (Bacillus subtilis штамм 534) и "Бактисубтила" (Bacillus cereus штамм IP 5832) (табл. 7).

Примеры экспериментального изучения полученного экстракта штаммов - продуцентов "Биоспорина":
1. Экспериментальной группе из 30 животных (белые мыши весом 18-20 г) ежедневно однократно в течение 10 суток вводили интраназально пипеткой 0,05 мл экстракта. Через 1 месяц животные из экспериментальной группы по внешнему виду, общему состоянию, поведенческим реакциям (число вставаний в минуту, характер походки, тремор, активность) не отличались от контрольной группы (не подвергавшейся действию экстракта). Через 5 суток после завершения эксперимента десяти мышам из экспериментальной группы ввели 0,01 мл экстракта под апоневроз задней лапки. Через 20 ч после введения достоверных отличий в толщине лапок у контрольных и опытных животных не выявлено, что указывает на отсутствие сенсибилизирующего действия. При вскрытии 10 животных экспериментальной группы (случайная выборка) патологических изменений со стороны внутренних органов не выявлено, что свидетельствует об отсутствии хронической токсичности.

2. Экспериментальным группам из 20 животных каждая (взрослые белые мыши весом 18-20 г) однократно вводили внутрибрюшинно экстракт в количестве 0,004, 0,02, 0,1 и 0,5 мл. В группе с дозой 0,5 мл (2,5% от массы тела) в течение 5 суток погибло 7 животных (35%). В процессе наблюдения экспериментальные животные из других экспериментальных групп (получившие дозы от 0,004 до 0,1 мл) не имели каких-либо отличий по общему состоянию и поведенческим реакциям по сравнению с контрольной группой, где экстракт не применяли. Через 10 суток после последней инъекции экстракта было произведено вскрытие 10 животных из каждой экспериментальной группы, при этом патологических изменений со стороны внутренних органов не выявлено. Это свидетельствует об отсутствии острой и хронической токсичности при использовании дозы 0,1 мл (0,5% от массы тела) и менее.

3. Экспериментальной группе животных (кролики весом 1,5-2 кг) ежедневно однократно в конъюнктивальный мешок нижнего века правого глаза вводили 0,1 мл экстракта в течение 10 суток. Левый глаз использовали в качестве контроля. При ежедневной оценке (и через 10 суток после завершения эксперимента) состояния конъюнктивы глаза и слизистой оболочки века каких-либо патологических изменений по сравнению с контрольным глазом не выявлено. Это свидетельствует об отсутствии раздражающего действия.

4. Зоны подавления роста пневмотропных бактерий экстрактом in vitro (при использовании метода отсроченного антагонизма - штрихов по Егорову Н.С.) составили:
Streptococcus pneumoniae (8 штаммов) - от 6 до 9 мм, β-гемолитический стрептококк группы А (7 штаммов) - от 4 до 10 мм, золотистый стафилококк (5 штаммов) - от 4 до 19 мм, Pseudomonas putida (3 штамма) - от 9 до 16 мм.

5. Экспериментальной группе белых мышей весом 18-20 г однократно внутрибрюшинно ввели 0,1 мл яичного желтка и 0,1 г гидрокортизона для подавления реакций иммунитета. Через 2 суток все 30 животных заразили интраназально 0,05 мл суспензии, содержащей 10⁹ в 1 мл пневмококка и 10⁹ β-гемолитического стрептококка группы А. Затем животных разделили на 3 группы:
- в первой (10 мышей) через 7 дней после заражения ежедневно однократно производилось интраназальное введение экстракта в количестве 0,05 мл в течение 10 суток;
- во второй (10 мышей) через 7 дней после заражения ежедневно проводилась аэрозольная терапия: в резервуаре объемом 5 л, куда помещали мышей, с помощью небулайзера распыляли 10 мл экстракта в течение 20 мин;
- третья группа (10 мышей) служила контролем (экстракт не применяли).

Через 20 суток наблюдения 2 мыши из контрольной группы погибли, у пяти отмечалось угнетенное состояние по поведенческим реакциям, а при вскрытии бактериологически выявлены пневмококки и β-гемолитический стрептококк, три мыши были практически здоровы. Все животные в первой и второй группах выжили, в ткани легких при вскрытии не выявлено возбудителей пневмококковой и стрептококковой инфекции.

6. Автор заявки на изобретение (врач, 32 года) болен хроническим обструктивным бронхитом в течение 5 лет. После перенесенного острого респираторного заболевания развилось обострение хронического обструктивного бронхита с субфебрильной температурой, усилением кашля и бронхо-обструктивного синдрома. При этом из мокроты высевались пневмококк (10⁸ в 1 мл) и золотистый стафилококк (5•10⁶ в 1 мл). После 10-дневного курса аэрозольной терапии экстрактом (по 2 мл вводили с помощью небулайзера дважды в сутки) наступило клиническое выздоровление, стафилококки в мокроте бактериологически не определялись, а содержание пневмококков снизилось до 4•10³ в 1 мл.

Предлагаемый способ возможно и целесообразно использовать для получения экстракта штаммов-продуцентов пробиотика "Биоспорин", который можно применять вместо антибиотиков при санации очагов инфекции в бронхиальном дереве с помощью аэрозольного способа введения у больных хроническим бронхитом и хроническим обструктивным бронхитом.

Источники информации, принятые во внимание
1. Регистр лекарственных средств России (РЛС). Дополнение / Гл. ред. Ю. Ф. Крылов. - М., 1995.

2. Земсков В.М., Караулов А.В., Земсков А.М., Назаретян А.В. - Иммуномодуляторы в терапии легочной патологии. - М., 1995.

3. Хаитов P. M. , Пинегин Б.В. Иммуномодуляторы и некоторые аспекты их клинического применения // Клиническая медицина. - 1996, - 8. - С.7-12.

4. Серегин А. Местная иммунизация в лечении и профилактике респираторных инфекций // РМЖ. - 2001. - Том 8. - С.56-58.

5. А.С. СССР 1398868, МКИ А 61 К 35/74, опубл. 1988.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к бактерийным препаратам - пробиотикам и может быть использовано для коррекции микроэкологических нарушений в бронхиальном дереве с помощью аэрозольного способа введения при хроническом бронхите и хроническом обструктивном бронхите. Штаммы-продуценты пробиотика "Биоспорин" - Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis, выращенные на мясо-пептонном агаре в течение 18-24 ч при температуре 37^oС, смывают с поверхности питательной среды дистиллированной водой. Приготавливают смесь их суспензией в дистиллированной воде в соотношении 1:3 с концентрацией 20 млрд микробных тел/мл (по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Проводят термолиз полученной бактериальной суспензии при температуре 70-80^oС в течение 60-70 мин. После этого проводят очистку термолизата от оставшихся бактериальных клеток и клеточного детрита центрифугированием при 3000 об/мин и фильтрацией через целлюлозный фильтр 3 в стеклянную тару. Получают прозрачный экстракт, представляющий собой готовую форму пробиотического препарата "Лизоспорин", обладающий антибактериальным действием на пневмотронные микроорганизмы. 7 табл., 1 ил.

Способ получения пробиотического препарата, обладающего антибактериальным действием на пневмотропные бактерии, характеризующийся тем, что осуществляют выращивание штаммов Bacillus subtilis ВКПМ В-2335 и Bacillus licheniformis ВКПМ В-2336 на мясо-пептонном агаре, приготовление смеси их суспензий в дистиллированной воде с концентрацией 20 млрд микробных тел/мл в соотношении 1:3 и термолиз при температуре 65-75°С в течение 55-65 мин с последующей очисткой от клеточного детрита центрифугированием при 3000 об/мин и фильтрацией через целлюлозный фильтр №3.