СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 1996 года по МПК C12Q1/04 C12Q1/04 C12R1/32 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к медицинской и ветеринарной микробиологии, и может быть использовано для лабораторной диагностики туберкулеза.

Известен способ выявления микобактерий туберкулеза, включающий гомогенизацию исследуемого материала 0,14%-ным раствором хлоргексидина биклюконикума с последующей инкубацией в течение 24 ч, центрифугирование исследуемого материала при 1500 об/мин и посев осадка на жидкую питательную среду (Современные методы лабораторной диагностики туберкулеза, методические рекомендации, М. 1992, c. 8).

Известный способ характеризуется низкой точностью лабораторной диагностики, так как применяемый для гомогенизации раствор хлоргексидина биклюконикума неудовлетворительно гомогенизирует исследуемый материал. Поэтому дополнительно требуется центрифугирование, которое в свою очередь отрицательно влияет на структуру и жизнеспособность микобактерий.

Известен также способ выявления микобактерий туберкулеза, включающий гомогенизацию исследуемого материала 10%-ным раствором трехзамещенного фосфорнокислого натрия с последующей инкубацией исследуемого материала при комнатной температуре в течение 24 ч, нейтрализацию раствором соляной кислоты до достижения pН 7 8 и посев исследуемого материала на питательную среду (Современные методы лабораторной диагностики, методические рекомендации, М. 1992, c. 4).

Известный способ также обладает низкой точностью лабораторной диагностики, так как инкубация исследуемого материала при комнатной температуре не позволяет с высоким качеством обработать его от посторонней микрофлоры, что в дальнейшем при посеве приводит к увеличению проростов посторонней микрофлоры. А наличие посторонней микрофлоры снижает выявляемость микобактерий туберкулеза, т.е. точность лабораторной диагностики.

Последующая обработка исследуемого материала соляной кислотой приводит к снижению жизнеспособности микобактерий туберкулеза, что также снижает точность лабораторной диагностики туберкулеза.

Наиболее близким к данному способу по технической сущности и достигаемому результату является способ выявления микобактерий туберкулеза, включающий гомогенизацию исследуемого материала путем встряхивания его со стеклянными бусами или битым стеклом, вторичную гомогенизацию путем встряхивания его с равным количеством десятипроцентного раствора трехзамещенного фосфорнокислого натрия и последующую инкубацию при комнатной температуре в течение 20 24 ч, после чего исследуемый материал центрифугируют, а выделенный осадок нейтрализуют пятипроцентным раствором соляной кислоты для последующего посева на питательную среду (Современные методы микробиологической диагностики туберкулеза, методические рекомендации, М. 1975, с. 15).

Недостатком указанного способа является то, что при его осуществлении не обеспечивается необходимая точность лабораторной диагностики за счет количественных потерь исследуемого материала, нарушения структуры и жизнеспособности микобактерий в нем.

Гомогенизация с помощью стеклянных бус или битого стекла ведет к адсорбции микобактерий на их поверхности, что и обуславливает количественные потери микобактерий в исследуемом материале. Кроме того, за счет механического воздействия бус или битого стекла на исследуемый материал возникает электростатическое поле, приводящее к распределению микобактерий по полюсам, то есть образуются новые конгломераты, вследствие чего и требуется повторная гомогенизация трехзамещенным фосфорнокислым натрием.

Выделение осадка центрифугированием приводит к нарушению структуры микобактерий, снижению их жизнеспособности, а последующая нейтрализация раствором сильной соляной кислоты вследствие экзотермической реакции на уровне оболочки клетки микобактерии приводит к дальнейшему снижению их жизнеспособности.

Следовательно, указанный способ не обеспечивает достаточную лабораторную точность диагностики и тем самым снижает достоверность последующего анализа результатов исследования.

В основу изобретения положена задача повышения точности лабораторной диагностики путем снижения количественных потерь, снижения нарушений структуры и жизнеспособности микобактерий в исследуемом материале при сокращении времени лабораторных исследований.

Поставленная задача решается тем, что в способе выявления микобактерий туберкулеза, включающем гомогенизацию исследуемого материала путем встряхивания его с равным количеством 10%-ного раствора трехзамещенного фосфорнокислого натрия, инкубацию исследуемого материала, выделение осадка, нейтрализацию его кислотой и посев осадка на питательную среду, гомогенизацию проводят, подвергая исследуемый материал колебаниям с амплитудой 0,5 2,5 мм, частотой 40 60 Гц в течение 10 20 мин, инкубацию осуществляют в течение 18 20 ч, а нейтрализацию осадка ведут карбоновой кислотой до достижения 6,8≅pH≅7,0 c последующим повторным выделением осадка и посева на питательную среду.

Гомогенизация исследуемого материала в присутствии трехзамещенного фосфорнокислого натрия посредством вынужденных колебаний с амплитудой 0,5 - 2,5 мм, частотой 40 60 Гц в течение 10 20 мин позволяет осуществить его полную гомогенизацию без количественных потерь на адсорбцию.

При меньшей амплитуде, частоте и времени не происходит полного освобождения от посторонней флоры (сгустков, комков, слизи).

Увеличение амплитуды, частоты и времени гомогенизации способствует нарушению структуры микобактерий и снижению тем самым числа жизнеспособных микобактерий.

Полностью гомогенизированный и жизнеспособный исследуемый материал позволяет осуществить инкубацию в течение 18 20 ч при температуре 37^oC, что сокращает ее время и приводит к сокращению сроков лабораторного исследования при обеспечении более полного выявления микобактерий, что повышает точность лабораторной диагностики.

Нейтрализация осадка карбоновой кислотой создает щадящий для микобактерий режим, не связанный с экзотермическим воздействием на них и тем самым не нарушающий их жизнеспособность.

С помощью нейтрализации карбоновой кислотой достигается нейтральная среда (6,8≅pH≅7,0), создающая оптимальные условия для микобактерий, являясь для них дополнительным питательным субстратом, что и способствует их сохранению.

В процессе нейтрализации карбоновой кислотой возникают за счет разности удельных масс микобактерий и надосадочной жидкости условия для осаждения последних близким к естественному путем и, следовательно, возможность повторного выделения осадка, тем самым увеличивая концентрацию микобактерий в исследуемом материале, что также повышает точность лабораторной диагностики туберкулеза.

Пример. В качестве исследуемого материала использовали мокроту, промывные воды бронхов, секрет бронхов и т.п. Исследуемый материал помещали в мерный флакон емкостью 100 мл. К исследуемому материалу в объеме 10 л добавляли 10 мл десятипроцентного раствора трехзамещенного фосфорнокислого натрия и производили встряхивание в режимах, приведенных в таблице 1. Исследовали 147 проб.

Из представленных данных таблицы 1 видно, что при последующем посеве наиболее оптимальными техническими условиями гомогенизации встряхиванием исследуемого материала является встряхивание с амплитудой колебаний 0,5 2,5 мм при частоте 40 60 Гц и продолжительности 10 20 мин, что способствует более высокой выявляемости (на 3±1%), а следовательно, повышению точности лабораторной диагностики.

Далее гомогенизированный исследуемый материал подвергали инкубации в термостате в режимах, указанных в таблице 2.

Из представленных данных таблицы 2 видно, что повторное выделение осадка способствует большей выявляемости МБТ из исследуемого материала в среднем на 3% и сокращает сроки исследования в среднем на 8 сут.

После инкубации надосадочную жидкость сливают, а осадок нейтрализуют лимонной кислотой до достижения pН 6,8.

Сравнительные данные использования карбоновых кислот для нейтрализации осадка приведены в таблице 3 (pН 6,8 7,0).

Из представленных данных таблицы 3 следует отметить преимущество использования карбоновых кислот для нейтрализации осадка, которое проявилось в большей высеваемости МБТ (на 6±2%), сокращению сроков исследования (на 6±1 сут) и проростов посторонней микрофлоры в 2 раза.

После нейтрализации лимонной кислотой повторно отделяют осадок для посева на питательную среду Левенштейна-Йенсена.

Таким образом, при выявлении микобактерий туберкулеза заявляемым способом точность лабораторной диагностики по сравнению с известным способом повышается в 1,5 2,0 раза при одновременном сокращении времени лабораторных исследований.

Использование: микробиология, медицинская и ветеринарная микробиология, лабораторная диагностика туберкулеза. Сущность изобретения: cпособ выявления микобактерий туберкулеза включает гомогенизацию исследуемого материала путем встряхивания его с равным количеством десятипроцентного раствора трехзамещенного фосфорнокислого натрия с амплитудой 0,5 - 2,5 мм и частотой 40 - 60 Гц в течение 10 - 20 мин, инкубацию исследуемого материала в течение 18 - 20 ч, выделение осадка, нейтрализацию его карбоновой кислотой до достижения 6,8≅pH≅7,0 c последующим повторным выделением осадка для посева на питательную среду. 3 табл.

Способ выявления микобактерий туберкулеза, включающий гомогенизацию исследуемого материала путем встряхивания его с равным количеством десятипроцентного раствора трехзамещенного фосфорнокислого натрия, инкубацию исследуемого материала, выделение осадка, нейтрализацию его кислотой и посев осадка на питательную среду, отличающийся тем, что гомогенизацию проводят, подвергая исследуемый материал колебаниям с амплитудой 0,5 2,5 мм, частотой 40 60 Гц в течение 10 20 мин, инкубацию осуществляют в течение 18 20 ч, а нейтрализацию осадка ведут карбоновой кислотой до достижения 6,8 ≅ pH ≅ 7,0 с последующим повторным выделением осадка для посева на питательную среду.