ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА (МБТ-БУЛЬОН) Российский патент 2002 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической микробиологии, и может быть использовано для ранней диагностики туберкулеза.

В последние годы наблюдается значительное повышение уровня показателей заболеваемости туберкулезной инфекцией.

В этой связи уделяется определенное внимание лабораторной диагностике туберкулеза, которая усложнилась появлением морфологически измененных форм возбудителя в результате широкого применения химиопрепаратов (1, 2, 5).

Использование жидких питательных сред для ускоренного выявления МБТ с последующей микроскопией осадка исследуемого материала позволяет обнаружить возбудителя через 5-11 суток, что очень важно для раннего начала лечения больных, не дожидаясь роста на плотных яичных средах (от 3 недель до 2,5 месяца).

Известно использование для этих целей жидких сред Сотона, Школьниковой Р. А. , модификацию среды Сотона с использованием мясокостного фарша тюленя, вместо бычьей сыворотки - сыворотку тюленя (4, 6, 7).

Недостатком этих сред является низкая чувствительность и использование дефицитных ингредиентов, а отсутствие коммерческого выпуска ограничивает их применение в практике фтизиобактериологии.

Наиболее близким решением технической задачи данного назначения к заявляемому изобретению по совокупности признаков является среда Школьниковой Р. А. (7), содержащая в качестве источника азотистого питания жидкий гидролизат казеина или аспарагин, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный, магний сернокислый, натрий лимонно-кислый, лимонно-аммиачное железо (зеленое), глицерин.

Задача предлагаемого изобретения - повышение ростовых свойств среды.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что предлагаемая среда содержит в качестве источника азотистого питания - сухой триптический гидролизат казеина и аминокислоту - аланин, в качестве ростового фактора - экстракт кормовых дрожжей, в качестве источника железа, магния и серы - лимонно-аммиачное железо и сернокислый магний, потребность в углероде удовлетворяется за счет глицерина, в качестве компонента, улучшающего синтетические процессы в культурах микобактерий туберкулеза использован натрий лимонно-кислый, источником калия и фосфора является калий дигидроортофосфат, для создания буферности и корректировки рН среды - динатрий фосфат, при следующем соотношении компонентов, г/л:
Триптический гидролизат казеина - 18,0-22,0
Экстракт кормовых дрожжей - 4,0-6,0
Аланин - 0,8-1,2
Калий дигидроортофосфат - 1,2-1,8
Динатрий фосфат - 2,0-3,0
Магний сернокислый - 0,3-0,7
Натрий лимонно-кислый трехзамещенный - 1,3-1,7
Железо лимонно-аммиачное (зеленое) - 0,03-0,07
Глицерин - 20,0-25,0
Вода дистиллированная - До 1 л
Богатая аминокислотами, имеющими значение в азотистом питании МБТ питательная основа из казеина в сочетании с аминокислотой аланином и ростстимулирующим препаратом - экстрактом кормовых дрожжей и минеральными солями, создают оптимальные условия для роста микобактерий туберкулеза, что обеспечивает возможность раннего их выявления в максимально короткие сроки, в течение 5-11 суток.

Среду получают следующим образом:
Пример 1. В 975,0 мл дистиллированной воды, содержащей 20,0 мл глицерина растворяют 18,0 г триптического гидролизата казеина, 4,0 г экстракта кормовых дрожжей, 0,8 г аланина, 1,2 г калия дигидроортофосфата, 2,0 г динатрия фосфата, 0,3 г магния сернокислого, 1,3 г натрия лимонно-кислого трехзамещенного, 0,03 г железа лимонно-аммиачного. Кипятят в течение 1-2 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в стерильные пробирки по 2 мл, стерилизуют автоклавированием при температуре 121^oС в течение 20 мин.

Контроль качества среды осуществляют при посеве тест-штаммов Mycobacterium tuberculosis H₃₇Rv, Mycobacterium tuberculosis H₃₇Ra и свежевыделенных культур от больных туберкулезом легких. Учет результатов проводят визуально по помутнению среды через 5-11 суток инкубации посевов при температуре 37^oС. После 5-11 суток инкубации содержимое пробирок центрифугируют при 1500 об/мин 15 мин. Надосадочную жидкость сливают, из осадка делают мазки для просмотра в люминесцентном микроскопе.

Пример 2. Отличается от примера 1 тем, что в 970,0 мл дистиллированной воды, содержащей 22,5 мл глицерина, растворяют 20,0 г триптического гидролизата казеина, 5,0 г экстракта кормовых дрожжей, 1,0 г аланина, 1,5 г калия дигидроортофосфата, 2,5 г динатрия фосфата, 0,5 г магния сернокислого, 1,5 г натрия лимонно-кислого, 0,05 г железа лимонно-аммиачного. Далее согласно примеру 1.

Пример 3. Отличается от примера 1,2 тем, что в 965,0 мл дистиллированной воды, содержащей 25,0 мл глицерина растворяют 22,0 г триптического гидролизата казеина, 6,0 г экстракта кормовых дрожжей, 1,2 г аланина, 1,8 г калия дигидроортофосфата, 3,0 г динатрия фосфата, 0,7 г магния сернокислого, 1,7 г натрия лимонно-кислого трехзамещенного, 0,07 г железа лимонно-аммиачного. Далее согласно примеру 1,2.

Результаты бактериологического контроля предлагаемой и известной сред представлены в таблице.

Из таблицы видно, что предлагаемая среда имеет преимущество, так как чувствительность предлагаемой среды составляет 10^-4, а известной 10^-3.

Таким образом, предлагаемая среда обеспечивает рост микобактерий туберкулеза, что способствует выявляемости их в максимально короткие сроки.

Источники информации
1. Дорожкова И.Р. Формы персистирования микобактерий туберкулеза в организме человека. Диссертация докт. M. 1974 г.

2. Капков Л. П., Аникин В.А., Корнеев А.А. Проблема обеспечения службы фтизиобактериологии в современных условиях. Материалы доклада Всероссийской научно-практической конференции 31 октября 1994 г., Махачкала, 1994 г., стр. 187.

3. Модель Л. А. Биология туберкулеза микобактерий и иммунология туберкулеза. М., 1958 г.

4. Методические рекомендации "Современные методы лабораторной диагностики туберкулеза" М., 1992 г.

5. Макаревич Н.М., Благодарный Н.А., Кадочкин А.М. и др. Методы и средства диагностики, терапии и профилактики инфекционных болезней животных. Труды НИЭВ, М., 1985 г, стр. 63.

6. Приказ 558 от 8 июня 1978 г. "Об унификации микробиологических методов исследования при туберкулезе" М., 1978 г.

7. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, М., "Медицина", 1973, стр. 80.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической микробиологии, и может быть использовано для ускоренного выявления микобактерий туберкулеза (МБТ) в клиническом материале при диагностике туберкулеза. Среда содержит в качестве источника азотистого питания сухой триптический гидролизат казеина, калий дигидроортофосфат, динатрий фосфат, магний сернокислый, натрий лимонно-кислый, железо лимонно-аммиачное (зеленое), глицерин, дистиллированную воду. Введение в качестве ростового фактора экстракта кормовых дрожжей и дополнительного источника азота-аланина повышает чувствительность среды по отношению к микобактериям туберкулеза. Коммерческий выпуск препарата позволит централизованно снабжать практические лаборатории фтизиобактериологии стандартной питательной средой. Изобретение обеспечивает повышение ростовых свойств среды. 1 табл.

Питательная среда для культивирования микобактерий туберкулеза, содержащая в качестве источника азотистого питания триптический гидролизат казеина, калий дигидроортофосфат, динатрий фосфат, магний сернокислый, натрий лимонно-кислый, железо лимонно-аммиачное (зеленое), глицерин, воду дистиллированную, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит экстракт кормовых дрожжей в качестве ростового фактора и аланин в качестве дополнительного источника азотистого питания при следующем соотношении компонентов, г/л:
Триптический гидролизат казеина (сухой) - 18,0-22,0
Экстракт кормовых дрожжей - 4,0-6,0
Аланин - 0,8-1,2
Калий дигидроортофосфат - 1,2-1,8
Динатрий фосфат - 2,0-3,0
Магний сернокислый - 0,3-0,7
Натрий лимоннокислый трехзамещенный - 1,3-1,7
Железо лимонно-аммиачное (зеленое) - 0,03-0,07
Глицерин - 20-25
Вода дистиллированная - До 1 л