СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ С ПОВЕРХНОСТЕЙ Российский патент 2002 года по МПК C12Q1/04 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к медицинской и ветеринарной микробиологии, и может быть использовано для лабораторной диагностики туберкулеза.

Известен способ выявления микобактерий с различных поверхностей, включающий смыв ватным тампоном, смоченным изотоническим раствором хлорида натрия с последующим перенесением материалов в банку с бусами, добавлением 10-ного раствора Na₃PO₄ и встряхиванием в течение 10 мин, инкубацию в термостате при 37^oС в течение 24 ч, перенос материала в пробирки, центрифугирование при скорости 1500 оборотов в 1 мин в течение 15 мин и посев осадка в 3-4 пробирки с питательными средами Левенштейна-Иенсена и Финн-2 (Н.И. Любкина, Бактериовыделители в условиях современной эпидемической ситуации по туберкулезу Дис... канд. мед наук. - М. - 1989).

Известный способ характеризуется низкой точностью лабораторной диагностики, так как применение для смыва ватного тампона, который в дальнейшем не используется для культивирования, ведет к количественным потерям микобактерий из-за их фиксации на вате.

Многочисленные манипуляции по переносу материала при обработке перед посевом повышают риск его дополнительного загрязнения другими микроорганизмами, что в дальнейшем приводит к увеличению числа проростов посторонней микрофлоры. Наличие проростов снижает выявляемость микобактерий туберкулеза, то есть точность лабораторной диагностики.

Культивирование в 3-4 пробирках с питательной средой ведет к дроблению посевного материала, следовательно, к снижению выявляемости микобактерий туберкулеза и удлинению сроков их роста.

Наиболее близким к данному способу по технической сущности и достигаемому результату является способ выявления микобактерий с поверхностей ватным тампоном, смоченным 5%-ным раствором хлорида натрия, включающий обработку перед посевом 4%-ным раствором КОН, нейтрализацию тампона и осадка 5%-ной лимонной кислотой, посев на плотные питательные среды Левенштейна-Иенсена и "Новая" (Н.В. Попцова \\Пробл. туберкулеза - 1974. - 8. - С.17-20).

Недостатком указанного способа является то, что при его осуществлении не обеспечивается необходимая точность лабораторной диагностики из-за количественных потерь исследуемого материала, нарушения жизнеспособности в нем микобактерий туберкулеза.

Обработка материала перед посевом для уничтожения посторонней микрофлоры 4%-ным раствором сильной щелочи снижает жизнеспособность микобактерий, так как не обеспечивает для них щадящих условий, что приводит к уменьшению выявляемости и более поздним срокам роста на питательных средах.

Посев осуществляется только на плотные питательные среды, что также не позволяет повысить выявлиемость микобактерий туберкулеза и ведет к удлинению сроков культивирования.

Следовательно, указанный способ не обеспечивает достаточную точность лабораторной диагностики и тем самым снижает достоверность последующего анализа результатов исследования.

В основу изобретения положена задача повышения точности лабораторной диагностики путем снижения количественных потерь и сохранения жизнеспособности микобактерий туберкулеза в исследуемом материале при сокращении времени лабораторных исследований.

Поставленная задача решается тем, что в известном способе выявления микобактерий с поверхностей путем сбора смоченным тампоном и последующего культивирования микобактерий в качестве тампона используют эластичный мелкопористый материал, смачивание и последующее инкубирование тампона осуществляют в растворе, ингибирующем развитие других микроорганизмов, и культивирование микобактерий, адсорбированных на тампоне и выделенных из раствора центрифугированием, производят раздельно на питательных средах.

В качестве мелкопористого материала используют поролон, который хорошо адсорбирует микроорганизмы при смыве и легко выделяет их при дальнейшем культивировании, что позволяет снизить количественные потери микобактерий туберкулеза.

Применение для смачивания тампона 5%-ного раствора Na₃PО₄, который одновременно служит для обработки материала от посторонней микрофлоры, позволяет увеличить выявляемость микобактерий, так как не нарушает их жизнеспособность и уменьшает число проростов посторонней микрофлоры, что повышает точность лабораторной диагностики.

Раздельное культивирование микобактерий, адсорбированных на тампоне и выделенных из раствора центрифугированием, а также использование для культивирования микобактерий, адсорбированных на тампоне жидкой или полужидкой питательной среды, обеспечивающей более полный контакт микобактерий с питательным субстратом, ведет к сокращению сроков роста и повышению выявляемости микобактерий туберкулеза, а следовательно, повышает точность лабораторной диагностики.

Пример применения способа
Тампон из мелкопористой поролоновой губки размером 15 мм•15 мм•15 мм (размер пор 0,1-0,3 мм) берут стерильным пинцетом, погружают в центрифужную пробирку с 5 мл 5%-ного раствора фосфорнокислого натрия трехзамещенного, отжимают слегка о стенки пробирки, производят смыв с поверхности предмета. После смыва тампон вновь погружают в смачивающий раствор. Пинцет перед очередным смывом стерилизуют обжиганием над пламенем спиртовки. Пробирки нумеруют и отправляют в лабораторию с сопроводительной документацией, где указаны дата проведения исследований, название учреждения, помещение и предметы, с которых взяты смывы. Для взятия смывов используют трафареты из алюминиевой или другой металлической проволоки, размером 10 см•10 см. Площадь смыва зависит от вида материала (см. табл. 1).

Одним тампоном берут смыв в одной точке, площадью 100 см² (например, с квадрата 10 см•10 см). Соответственно пятью тампонами смыв берут в 5 точках, десятью - в 10 и т.д. Если площадь исследуемого объекта меньше 100 см², то смыв берут одним тампоном с нескольких предметов, изготовленных из одного материала: с двух вентилей кранов, с трех дверных ручек и т.п. Для проведения исследовании предметов, имеющих изогнутую поверхность (раковина), однократно используют гибкие бумажные трафареты.

Доставленные в лабораторию пробирки со смывами инкубируют в термостате в течение 18-24 ч при температуре 37^oС для уничтожения микрофлоры загрязнения. По окончании инкубации проводят посев материала. Тампон берут стерильным пинцетом, отмывают в пробирке со смачивающим раствором, в которую он был погружен, слегка отжимают о стенки пробирки и засевают в жидкую или полужидкую питательную среду (например, среду Миддлбрука-Дюбо).

После удаления тампонов раствор центрифугируют при скорости 3000 оборотов в 1 мин в течение 15 мин, надосадочную жидкость сливают, осадок нейтрализуют 1%-ным раствором лимонной кислоты (в соотношении 1:1) и засевают поровну в 2 пробирки со средами (например, со средами Левенштейна-Иенсена и "Новая").

Посевы на жидкой среде культивируют в термостате при 37^oС, начиная с 5 дня после посева, производят дважды в неделю просмотр посевов. При появлении видимого роста готовят мазки, для чего пипеткой забирают 0,1 мл верхнего слоя среды, помещают на стекло, высушивают, окрашивают люминофорами или по методу Циль-Нильсена.

Пробирки с посевами на плотных питательных средах помещают в термостат при 37^oС на 10 суток в горизонтальном положении, затем переводят в вертикальное положение и инкубируют до 3 месяцев. Просмотр посевов осуществляют еженедельно для выявления роста микобактерий и удаления пробирок с проростами. Отрицательный результат при отсутствии роста выдают через 12 недель после посева. При наличии роста дальнейшие исследования проводят по общепринятым методикам.

Сравнительные данные использования для смыва ватного и поролонового тампонов представлены в табл. 2.

Из представленных данных табл. 2 следует отметить преимущество применения для смыва поролонового тампона, которое проявилось в повышении выявляемости микобактерий туберкулеза (штамм H₃₇Rv), нанесенных на поверхность стекла в различных концентрациях (100-10000 микробных тел/мл), в 1,3-1,5 раза по сравнению с ватным тампоном.

Из представленных данных табл. 3 видно, что применение для смачивания тампона 5%-ного раствора Na₃P0₄, одновременно угнетающего рост других микроорганизмов, способствует повышению выявляемости микобактерий туберкулеза в 1,3-1,5 раза и уменьшению числа проростов посторонней микрофлоры в среднем в 2,3 раза по сравнению с прототипом.

Сравнительные данные использования предложенного способа с прототипом для определения загрязненности микобактериями различных поверхностей представлены в табл. 4.

Из представленных данных табл. 4 видно, что применение предложенного способа для исследования загрязненности микобактериями туберкулеза различных поверхностей в помещениях противотуберкулезных учреждений позволило повысить выявляемость микобактерий туберкулеза в 1,8 раза и сократить сроки исследования в 2,1 раза.

Таким образом, при выявлении микобактерий туберкулеза заявляемым способом точность лабораторной диагностики по сравнению с известным способом повышается в среднем в 1,8 раза при одновременном сокращении времени лабораторных исследований.

Изобретение относится к медицинской и ветеринарной микробиологии. Может быть использовано при лабораторной диагностике туберкулеза. Способ включает сбор смоченным тампоном и культивирование микобактерий. В качестве тампона используют эластичный мелкопористый материал. Смачивание и инкубирование тампона осуществляют в растворе, ингибирующем развитие других микроорганизмов. Культивируют микобактерии, адсорбированные на тампоне и выделенные из раствора центрифугированием, раздельно на питательных средах. Изобретение направлено на повышение выявляемости микобактерий и сокращение сроков исследования. 2 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Способ выявления микобактерий с поверхностей путем сбора смоченным тампоном и последующего культивирования микобактерий, отличающийся тем, что в качестве тампона используют эластичный мелкопористый материал, смачивание и последующее инкубирование тампона осуществляют в растворе, ингибирующем развитие других микроорганизмов, и культивируют микобактерии, адсорбированные на тампоне и выделенные из раствора центрифугированием, раздельно на питательных средах. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве эластичного мелкопористого материала используют поролон. 3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что смачивание осуществляют 5%-ным раствором фосфорно-кислого натрия трехзамещенного.