ЛИПОСОМАЛЬНАЯ ВЕЗИКУЛА С ЦИТОХРОМОМ С Российский патент 1998 года по МПК A61K9/127 

Описание патента на изобретение RU2110990C1

Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии, и может быть использовано для получения липосом, содержащих биологически активное терапевтическое вещество, а именно цитохром C.

Естественный переносчик электронов - фермент тканевого дыхания цитохром C (Цитохром C для инъекции, ФС 42-2533-88, срок введения 11.06.88) используется как лекарственное средство в различных областях медицины. Являясь слабо закрепленным на митохондриальной мембране, цитохром C легко теряется организмом, но в то же время способен замещаться экзогенным препаратом. Однако лекарственная форма водорастворимого цитохрома C имеет существенные недостатки - препарат не проникает через биологические мембраны в клетку и быстро выводится из организма. Проникновению водорастворимого препарата через липидные участки биомембран, а также удержанию его в деструктивных участках организма способствует его инкапсулирование в липосомальную оболочку.

Липосомальные везикулы, содержащие цитохром C, в литературе не описаны, хотя везикулы, содержащие терапевтические вещества, известны.

Известны липосомальные везикулы, содержащие ингибиторы моноаминооксидазы (авт. св. СССР N 1570071, кл. A 61 K 47/00, опублик. 22.02.89). В качестве липидного компонента эти везикулы содержат лецитин, который смешивают с ингибитором в соотношении (мкМ) 200-300 (лецитин) к 0,01-10 (ингибитор).

Наиболее близкой по составу липидной оболочки к заявляемой липосомальной везикуле является везикула с липидной оболочкой из фосфолипидов, содержащая инкапсулированный инсулин (патент СССР N 1158031, кл. A 61 K 9/50, 1985). В качестве фосфолипидов оболочка известной везикулы содержит лецитин и холестерол, а также она может содержать токоферол, фосфатидилсерин и другие индивидуальные соединения.

В основу изобретения положена задача создания липосомальных везикул с цитохромом C, обеспечивающих более высокую терапевтическую эффективность и пролонгированность действия цитохрома C по сравнению с нативной формой.

Указанная цель достигается тем, что липосомальная везикула с липидной оболочкой, состоящей из лецитина и холестерола, дополнительно содержит в липидной оболочке смесь кислых фосфолипидов, выделенную как единый отрицательно заряженный фосфолипидный компонент, и инкапсулированный цитохром C, взятый в массовом соотношении к липидной оболочке, равном 1 : (6-8).

Липидная оболочка может дополнительно содержать токоферол, взятый в количестве 1,1-2,2% от общей массы липидов.

Смесь кислых фосфолипидов выделена из кефалиновой фракции отходов производства соевого лецитина и имеет следующие свойства:
Кислотное число, мг KOH - 55,0 - 56,0
Содержание фосфора, % - 1,7 - 1,8
Цветность, мг J2 - 13,0 - 14,0
Перекисное число, % J2 - 0,1 - 0,2
Содержание диенов, % - 0,7 - 0,8
Содержание триенов, % - 0,1 - 0,2
Смесь кислых фосфолипидов вводится в липидную оболочку в количестве, равном 10-11% от общей массы всех фосфолипидов. Введение смеси кислых фосфолипидов в липидную оболочку липосом придает им повышенную стабильность при хранении.

Для подтверждения возможности осуществления изобретения были получены липосомальные везикулы с цитохромом C.

Пример 1. Раствор мембранообразующих компонентов, а именно соевый лецитин (СЛ), холестерол (ХЛ), отрицательно заряженный фосфолипидный компонент (ОЗФК) (или, что то же, смесь кислых фосфолипидов) и ДL-α-токоферол (ТФ) при соотношении компонентов 55:25:10:1, в хлороформе высушивали в круглодонной колбе на роторном испарителе до образования пленки, которую дополнительно высушивали 10 ч в вакуумном эксикаторе. К полученной пленке добавляли 0,3%-ный раствор цитохрома C в дисперсионной среде при соотношении липидсодержащих компонентов и цитохрома C 8:1, перемешивали в течение 15 мин и озвучивали (мощность 400 Вт, рабочая частота 22 кГц) в течение 10 мин при 0oC. Эмульсию липосом стерилизовали и разливали во флаконы.

Полученная эмульсия липосом исследовалась по следующим параметрам. Дисперсность исследовалась методом спектротурбидиметрии. Для контроля перекисного окисления липидов (ПОЛ) использовали "индекс Клейна" или индекс окисленности, представляющий собой отношение оптической плотности липидного экстракта при 233 нм за счет присутствия сопряженных диеновых гидроперекисей к оптической плотности при 215 нм. Промежуточные соединения при ПОЛ, диеновые конъюгаты (ДК), определяли спектрофотометрическим методом. Вторичные продукты ПОЛ, например малоновый диальдегид (МДА), определяли с помощью теста тиобарбитуровой кислоты.

Кислотность среды (pH) измеряли с помощью pH-метра.

Определение концентрации цитохрома C проводили методом дифференциальной спектрофотометрии. Содержание цитохрома C, не включенного в липосомальную везикулу, определяли по разности оптических плотностей восстановленной и окисленной форм цитохрома C до прибавления к липосомам тритона X-100. Оно составляет 40-45% от общего содержания цитохрома C в эмульсии, которое определяли после раскрытия липосом тритоном X-100. Таким образом, процент инкапсулирования при данном способе получения составляет 55-60%. Не включенный в липосомы цитохром C отделяли ультрафильтрацией через фильтры Халипор-3 (20000), дисперсионную среду заменяли на сорбит-фосфатный буфер. Однако стадию определения можно и не проводить.

Результаты испытания липосомальной эмульсии приведены в табл. 1.

Примеры 2-4. Липосомы получали как в примере 1, но меняли соотношения липидсодержащих компонентов и цитохрома C, а также время озвучивания и температуру.

Исследование физико-химических характеристик полученных липосом проводили как в примере 1. Результаты представлены в табл. 1.

Для доказательства терапевтической эффективности липосом с цитохромом C были проведены исследования на крысах на модели окклюзии коронарной артерии.

Исследования проводили следующим образом.

Беспородным крысам-самцам массой 200-250 г за 15 мин до окклюзии коронарной артерии внутрибрюшинно вводили цитохром C в дозе 0,4 мг/кг в физиологическом растворе или в виде липосом, полученных по примеру 1. Острую окклюзию коронарной артерии вызывали перевязкой нисходящей ветви левой коронарной артерии у крыс под эфирным наркозом. Изучалась частота развития ранних постокклюзионных аритмий (частые политонные экстрасистолы, фибрилляция желудочков). Данные исследования представлены в табл. 2.

Как видно из данных табл. 2, при профилактическом введении цитохрома C в нативном виде наблюдается тенденция к уменьшению частоты возникновения ранних аритмий, тогда как введение цитохрома C в липосомах при той же концентрации (дозе) достоверно снижает число аритмий по сравнению с контролем, что свидетельствует о большей эффективности липосомальной формы препарата (в 2 раза).

Следующим этапом доказательства терапевтической эффективности липосом с цитохромом C послужило исследование кардиопротекторных свойств препарата на модели острой ишемии миокарда. Исследование проводили на 32 крысах следующим образом.

Беспородным крысам-самцам массой 200-250 г дважды (сразу после окклюзии артерии и спустя 6 ч) внутрибрюшинно вводили цитохром C в дозе 0,4 мг/мл в физиологическом растворе и в виде липосом, полученных по примеру 1. Экспериментальный инфаркт миокарда (ишемию) вызывали перевязкой нисходящей ветви левой коронарной артерии под эфирным наркозом. Оценивали индекс повреждения на 7-е сутки. Сердца взвешивали и замораживали в криостате при -20oC. Желудочки разрезали на четыре параллельных сегмента от верхушки к основанию. С каждого сегмента готовили криостатные срезы, в которых гистохимическим методом определяли сукцинатдегидрогеназу, что позволяло идентифицировать зону инфаркта. С помощью планиметра определяли суммарную величину зоны инфаркта во всех сегментах сердца, которую относили к его массе. Полученный индекс позволял судить о размерах повреждения (табл. 3).

Как видно из данных табл. 3, при введении нативной формы цитохрома C наблюдается уменьшение индекса повреждения миокарда с 30,3 до 18,3%, в то время как введение липосом с цитохромом C при той же дозе приводит к уменьшению индекса повреждения до 13,8%, что в 1,4 раза эффективнее. Показана достоверность улучшения значений фосфокреатина и АТФ по сравнению с действием нативной формы цитохрома C в 1,4 раза.

Для доказательства пролонгированности действия липосомальных везикул с цитохромом C у 32 крыс определяли концентрацию цитохрома C в моче после лечения ишемии нативной формой цитохрома C и липосомальными везикулами с цитохромом C.

Установлено, что концентрация цитохрома C в моче животных, которым вводили нативную форму цитохрома C, достоверно выше (p<0,02), чем при лечении липосомальными везикулами с цитохромом C (0,1 мг/мл против 0,01 мг/мл), что свидетельствует о значительном пролонгировании действия липосомальной формы препарата.

Таким образом, предлагаемые липосомальные везикулы с цитохромом C обеспечивают повышенную терапевтическую эффективность (в 1,4-2,0 раза) при изученных патологиях и пролонгированность действия по сравнению с нативной формой цитохрома C.

Похожие патенты RU2110990C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОСОМ 1994
  • Шанская А.И.
  • Булушева Е.В.
  • Яковлева Т.Е.
  • Недачина Н.А.
RU2071765C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫХ ЛИПОСОМ 1997
  • Шанская А.И.
  • Иванова Р.П.
  • Булушева Е.В.
  • Яковлева Т.Е.
  • Милицина Т.В.
RU2144352C1
ЛИПОСОМНАЯ ВЕЗИКУЛА 1993
  • Шанская А.И.
  • Яковлева Т.Е.
  • Булушева Е.В.
  • Недачина Н.А.
  • Пучкова С.М.
RU2084219C1
СРЕДСТВО ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ИНФЕКЦИОННОГО ЛАРИНГОТРАХЕИТА ПТИЦ 1998
  • Придыбайло Н.Д.
  • Шанская А.И.
  • Коровин Р.Н.
  • Селиванов Е.А.
  • Булушева Е.В.
  • Шорников В.В.
  • Радчук Л.А.
  • Белкина И.В.
  • Новосадюк Т.В.
  • Яковлева Т.Е.
  • Недачина Н.А.
  • Пучкова С.М.
RU2138290C1
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ УПРАВЛЯЕМОГО ВЫСВОБОЖДЕНИЯ СЛАБОКИСЛОТНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ 2019
  • Кань, Пей
  • Линь, И Фон
  • Чэнь, Кочиэй
RU2810790C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАГНИТОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ЛИПОСОМ 2007
  • Федущак Таисия Александровна
  • Дамбаев Георгий Церенович
  • Антипов Сергей Анатольевич
  • Хлусов Игорь Альбертович
  • Ермаков Анатолий Егорович
  • Уймин Михаил Александрович
  • Итин Воля Исаевич
RU2357724C1
ГИДРАТАНТНЫЙ РЕГЕНЕРИРУЮЩИЙ КРЕМ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ 1998
  • Кузякова Л.М.
  • Ефременко В.И.
  • Умнов А.В.
RU2139041C1
ЛИПОСОМАЛЬНОЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ УБИХИНОЛА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ 2015
  • Демченко Дмитрий Валентинович
  • Пожарицкая Ольга Николаевна
  • Шиков Александр Николаевич
  • Макаров Валерий Геннадьевич
  • Макарова Марина Николаевна
RU2605616C1
ЛИПОСОМНЫЕ КОМПОЗИЦИИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ 2015
  • Хонг Килунг
  • Дрюммонд Дэрил С.
  • Кирпотин Дмитрий В.
RU2757110C2
СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЛИПОСОМАЛЬНОГО ИНТЕРФЕРОНА 1995
  • Мотавкина Н.С.
  • Каленик Т.К.
  • Федорищева Л.В.
  • Пинчук В.А.
RU2125887C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 110 990 C1

Реферат патента 1998 года ЛИПОСОМАЛЬНАЯ ВЕЗИКУЛА С ЦИТОХРОМОМ С

Липосомальная везикула с липидной оболочкой, состоящей из лецитина и холестерола, предназначена для использования в медицине, в частности в фармакологии. Липидная оболочка везикулы дополнительно содержит смесь кислых фосфолипидов. Указанная смесь выделена как единый отрицательно заряженный фосфолипидный компонент из соевых фосфатидов. Везикула дполнительно содержит инкапсулированный цитохром C, взятый в соотношении к липидной оболочке (мас. ч.), равном 1 : (6 - 8). Липидная оболочка везикулы может дополнительно содержать токоферол, взятый в количестве 1,1 - 2,2% от общей массы липидной оболочки. Предлагаемая везикула обеспечивает повышенную терапевтическую эффективность и пролонгированность действия по сравнению с нативной формой цитохрома C. 3 табл.

Формула изобретения RU 2 110 990 C1

1. Липосомальная везикула с липидной оболочкой, состоящей из лецитина и холестерола, отличающаяся тем, что липидная оболочка везикулы дополнительно содержит смесь кислых фосфолипидов, выделенную как единый отрицательно заряженный фосфолипидный компонент из соевых фосфатидов, а везикула дополнительно содержит инкапсулированный цитохром С, взятый в соотношении к липидной оболочке (мас.ч.), равном 1 : (6 - 8). 2. Везикула по п.1, отличающаяся тем, что липидная оболочка дополнительно содержит токоферол, взятый в количестве 1,1 - 2,2% от общей массы липидной оболочки.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 1998 года RU2110990C1

Способ получения липосом 1978
  • Мишель Шнейдер
SU1158031A3

RU 2 110 990 C1

Авторы

Шанская А.И.

Криворучко Б.И.

Булушева Е.В.

Яковлева Т.Е.

Пучкова С.М.

Недачина Н.А.

Смирнов А.В.

Кашина Е.А.

Даты

1998-05-20Публикация

1994-07-14Подача