ГАЗОГЕНЕРИРУЮЩИЙ ПАКЕТ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КАМПИЛОБАКТЕРИЙ Российский патент 1997 года по МПК C12M1/04 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к способам выделения и культивирования микроаэрофильных бактерий рода Campylobacter и может быть использовано при исследовании клинического материала от людей и животных, а также выделения этих возбудителей из объектов внешней среды.

Прототипом предлагаемого изобретения по поставленной задаче является газогенерирующий пакет фирмы Merk (Германия) Anaerocult C, описание которого проводится в Merk catalog N 16275, 1991 (Germany).

Недостатком газогенерирующего пакета-прототипа является неоптимальный состав газогенерирующей смеси (мас. железный порошок 9,0; инертный носитель 60,0); а также его несовершенная конструкция (оболочка из однослойной газопроницаемой гигроскопической бумаги); обуславливающие протекание реакции до помещения пакета в анаэростат, что в целом приводит к высокому содержанию кислорода в генерируемой прототипом искусственной атмосфере (9-10% об.) и ухудшению микроаэрофильных условий культивирования кампилобактерий.

Задачей изобретения является разработка газогенерирующего пакета, в котором новые технические характеристики обеспечивали бы оптимальную микроаэрофильную среду для кампилобактерий при культивировании в анаэростатных условиях.

Задача достигается путем подбора оптимальных количественных и качественных компонентов реакционной смеси, состоящей из (мас.): поглотителя кислорода мелкодисперсного железного порошка 14,3 16,2; ускорителя поглощения кислорода виноградной кислоты (ТУ 6-09-3939-84) 18,5 19,7; источника углекислого газа безводного карбоната натрия 3,8 4,4; инертного наполнителя силикагель марки МСА-2500 63,4 59,7. Компоненты смеси после просеивания на калибровочных ситах отбирают с размерами частиц не более 0,1 мм, тщательно перемешивают до получения однородной смеси. Смесь в количестве 6,3 6,8 г помещают в оболочку из двойной водостойкой газопроницаемой бумаги (ТУ ДПВ-0281041-206-93) размером 60х60 мм и упаковывают путем заклеивания нагревателем в специальном приспособлении при температуре 140 160^oС. Перед применением каждую сторону пакета равномерно увлажняют дистиллированной водой с помощью пипетки по 2,5 мл и немедленно помещают в анаэростат. Закрытый анаэростат с исследуемым материалом культивируют при 37 42^oС в термостатных условиях.

Новым по сравнению с прототипом является применение виноградной кислоты, вместо лимонной, что ускоряет поглощение кислорода железным порошком и обуславливает уменьшение в 1,5 раза массы компонентов реакционной смеси (прототип 10 кг; по изобретению 6,5 кг) и в 4,5 раза размера пакета (прототип 115х70 мм; по изобретению 60х60 мм. Новая конструкция предлагаемого пакета, состоящая в применении двухслойной газопроницаемой водостойкой бумаги, вместо однослойной в прототипе, предотвращает выделение углекислого газа и поглощение кислорода из реакционной смеси до помещения пакета в анаэростат. Вышеизложенные нововведения обеспечивают стабилизацию микроаэрофильных условий (О₂ 5 7% об. СО₂ 8 10% об.) культивирования кампилобактерий в анаэростате объемом 2,5 3,0 л.

П р и м е р 1. Для приготовления оптимального варианта реакционной смеси компоненты берут в следующих количествах, мас. мелкодисперсный железный порошок 15,3; виноградная кислота 19,1; безводный карбонат натрия 4,1; силикагель 61,6. Полученную смесь тщательно перемешивают и в количестве 6,6 г помещают в оболочку из двойной водостойкой газопроницаемой бумаги размером 60х60 мм и упаковывают путем заклеивания нагреванием.

Изучение состава газогенерирующей смеси проводят на лабораторной установке, состоящей из анаэростата и пробоотборника для отбора пробы газа шприцем. Анаэростат помещают в суховоздушный термостат ТС-80, позволяющий производить исследования при различных температурах. После увлажнения газогенерирующий пакет помещают в анаэростат, герметически закрывают крышкой и ставят в термостат. Через 24 ч отбирают пробы газа из анаэростата медицинскими шприцами по 1 мл. Анализируют отобранные пробы на содержание кислорода и углекислого газа на хроматографе лабораторном ЛМХ-72.

Результаты исследования состава газогенерирующей смеси представлены в табл. 1.

П р и м е р 2. Для изучения чувствительности культивирования при помощи газогенерирующих пакетов эталонные штаммы кампилобактерий (С.jejuni M 457 Z, C.coli N 602, C.laridis N 729) выращивают на селективной плотной питательной среде следующего состава, г/л: ферментативный гидролизат казеина неглубокой степени расщепления 14,5; натрий хлористый 6,0; глюкоза медицинская 4,8; натрий углекислый 0,5; тиогликолят натрия 0,2; цистеина гидрохлорид 0,72; аэротолерантные добавки: железо сернокислое закисное, метабисульфит натрия, цируват натрия по 0,3; витаминный препарат экстракта кормовых дрожжей (сухой) 4,7; агар агар 26,0. Среду стерилизуют при 1 атм. (121^oС) 20 мин. После остывания до 45 50^oС в среду дополнительно вносится дефибринировання и гемолизировання баранья кровь 21,2 г, рН 7,2. Среду тщательно взбалтывают и разливают в стерильные чашки Петри по 20 25 мл. После застывания среды чашки подсушивают в термостате в течение 30 40 мин. Эталонные штаммы высевали в количестве 0,1 мл взвеси заданной концентрации. Посевы инкубировали 48 ч при 42^oС в микроаэрофильных условиях, создаваемых при помощи газогенерирующих пакетов.

Оценку эффективности выделения кампилобактерий с применением газогенерирующих пакетов проводят на вышеприведенной селективной питательной среде с добавлением смеси антибиотиков, взятых в следующих концентрациях, г/л: амфотерицин В 0,0015; полимиксин М 0,001; рифампицин 0,01; ристомицин 0,1. Посев исследуемого материала (испражнения диарейных больных) осуществляют шпателем равномерно распределяя его по всей поверхности чашки. Результат учитывают после 40-часовой инкубации в искусственной газовой среде анаэростата при 42^oС.

Результаты исследования чувствительности культивирования кампилобактерий и эффективности их выделения при помощи газогенерирующих пакетов приведены в табл. 2 и 3.

Определение стабильности биологических свойств кампилобактерий осуществляют путем посева 0,1 мл взвеси культур каждого эталонного штамма из разведений 10⁶ и последующего инкубирования в микроаэрофильных условиях, созданных при помощи предлагаемых газогенерирующих пакетов, при температуре 42^oС. Учет результатов производят через 48 ч. Кампилобактерии образуют на селективной среде колонии двух типов. Первый негемолитические, сероватые, плоские, влажные, блестящие, как бы растекающиеся, прозрачные. Второй более плотные, оформленные, выпуклые и блестящие.

В мазках, окрашенных по Граму, кампилобактерии просматриваются как грамотрицательные палочки, изогнутые в виде спиралей, запятых. При микроскопии в темном поле зрения обнаруживают подвижность.

Кампилобактерии продуцируют оксилазу и каталазу, растут при 42^oС и при 37^oС, но не растут при 25^oС, не ферментируют углеводы. C.jejuni вызывают гидролиз гиппурата.

Таким образом, предлагаемый газогенерирующий пакет по чувствительности культивирования кампилобактерий превосходит прототип в 2,0 2,3 раза, а по эффективности выделения культур из исследуемого материала 2,3 раза. Создаваемая искусственная микроаэрофильная среда обеспечивает ростовые потребности высокотребовательных к условиям культивирования кампилобактерий с сохранением их биологических свойств.

Удешевление достигается путем уменьшения количества компонентов реакционной смеси газогенерирующего пакета в 1,5 раза.

Изобретение целесообразно использовать в бактериологических лабораториях практических и научных учреждений медицинского и ветеринарного профиля. Использование предлагаемых газогенерирующих пакетов позволит повысить выявляемость возбудителей кампилобактериоза из различных объектов, что обеспечит проведение целенаправленных противоэпидемических мероприятий и снижение уровня диарейных заболеваний населения.

Предлагаемый газогенерирующий пакет технологичен в производстве и его выпуск может быть легко налажен предприятиями химической промышленности.

Назначение: изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к способам выделения и культивирования микроаэрофильных бактерий рода Campylobacter и может быть использовано при исследовании клинического материала от людей и животных, а также выделения этих возбудителей из объектов внешней среды. Сущность изобретения: пакет представляет собой герметичную оболочку из двуслойной газо- и водопроницаемой бумаги. В оболочку помещена смесь, содержащая мелкодисперсный порошок железа, виноградную кислоту, безводный карбонат натрия и наполнитель. В качестве наполнителя может быть использован силикагель. 1 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Газогенерирующий пакет для выделения и культивирования компилобактерий, содержащий герметичную оболочку из газо- и водопроницаемой бумаги, в которую помещена смесь порошка железа, безводного карбоната натрия, инертного наполнителя и ускорителя поглощения кислорода, отличающийся тем, что оболочка выполнена двуслойной из водостойкой бумаги, в качестве ускорителя поглощения кислорода использована виноградная кислота, порошок железа использован в мелкодисперсной форме при следующем соотношении компонентов, мас.

Мелкодисперсный порошок железа 14,3 16,2
Виноградная кислота 18,5 19,7
Безводный карбонат натрия 3,8 4,4
Инертный наполнитель 59,7 63,4
2. Пакет по п.1, отличающийся тем, что в качестве инертного наполнителя использован силикагель.