СПОСОБ СОЗДАНИЯ БЕСКИСЛОРОДНОЙ АТМОСФЕРЫ, ОБОГАЩЕННОЙ ВОДОРОДОМ И УГЛЕКИСЛЫМ ГАЗОМ, ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АНАЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2004 года по МПК C12N1/00 C12Q1/02 C01B3/08 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в любых микробиологических лабораториях, проводящих работу с анаэробными микроорганизмами.

Анаэробные микроорганизмы (анаэробы) составляют абсолютное большинство нормальной микрофлоры человеческого организма и выполняют ряд важнейших физиологических функций.

Однако многие виды анаэробов являются оппортунистическими патогенами и способны вызывать ряд серьезных заболеваний. Особенно велика их роль в развитии хирургических и акушерско-гинекологических инфекций, таких как абсцессы, перитонит, аспирационная пневмония, инфекции челюстно-лицевой области, послеродовые и послеабортные инфекционные осложнения.

В большинстве случаев эти инфекции имеют неспецифическую клиническую картину и полимикробную этиологию с вовлечением аэробных и анаэробных микроорганизмов при ведущей роли последних.

Поэтому микробиологическая диагностика таких инфекций с выделением, идентификацией и определением лекарственной чувствительности возбудителей имеет очень важное практическое значение.

Однако в подавляющем большинстве микробиологических лабораторий России диагностика ограничивается определением аэробных бактерий, в то время как анаэробы остаются вне поля зрения. Все это приводит к неточной, искаженной диагностике и как следствие к значительному ухудшению результатов лечения.

Основной причиной подобной ситуации является слабая материально-техническая база, т.к. анаэробы нуждаются в особых условиях культивирования. Для их создания необходимы дорогостоящее оборудование и расходные материалы.

Культивирование анаэробов наиболее часто проводят с использованием анаэробных культиваторов (анаэростатов). Анаэростаты представляют собой герметично закрывающиеся сосуды, внутри которых помещаются емкости с засеянными питательными средами (чашки Петри, пробирки и т.д.) и создается атмосфера нужного состава.

Оптимальной для культивирования анаэробов считается бескислородная атмосфера (содержание О₂ не более 0,01%), обогащенная H₂ (около 10%) и CO₂ (5-10%).

Наиболее экономичным способом создания такой атмосферы является вакуум-заместительный метод. Для этого из анаэростата, содержащего палладиевый катализатор, откачивают воздух до разрежения 1 атм, после чего производят его заполнение трехкомпонентной бескислородной газовой смесью, которая должна состоять из 80% N₂, 10% С0₂, 10% Н₂ [1].

Однако такая смесь в промышленных условиях не выпускается и может быть изготовлена по заказу только на единичных предприятиях, имеющих специальное оборудование. Значительную долю затрат при приобретении трехкомпонентной газовой смеси составляют транспортные расходы. Это связано с тем, что водород является огнеопасным газом, поэтому хранение и транспортировка баллонов с водородсодержащим газом требует соблюдения специальных мер безопасности, что значительно увеличивает стоимость транспортировки.

Вместо трехкомпонентной газовой смеси допускается использование более дешевого и доступного азота либо другого инертного газа, однако без обогащения атмосферы водородом и углекислым газом культивирование анаэробов затруднительно [1].

Другим способом создания оптимальной для анаэробов атмосферы в анаэростатах (взятый авторами за прототип) является использование химической реакции поглощения кислорода и выделения водорода и углекислого газа. Для этого применяются одноразовые газогенераторные пакеты импортного производства. Принцип действия таких пакетов заключается в генерации Н₂ при взаимодействии борогидрида натрия с водой, часть которого связывает кислород с помощью палладиевого катализатора. СО₂ образуется в результате реакции лимонной кислоты с гидрокарбонатом натрия. Газогенераторные пакеты активируют добавлением в них воды непосредственно перед помещением в анаэростат. Вода проникает через серию каналов на фитиль из фильтровальной бумаги, который задерживает ее поступление к реактивам и, следовательно, начало выделения газов. [2, 6]. Это необходимо для предотвращения потерь газов до герметизации анаэростата.

Главный недостаток метода - низкая скорость создания анаэробных условий (2-3 ч) [3], что затрудняет культивирование наиболее чувствительных к кислороду анаэробных бактерий, т.к. при контакте с кислородом многие виды погибают в течение 30 мин. Другим недостатком является высокая стоимость газогенераторных пакетов за счет дорогостоящих реактивов (один пакет стоит около 2$ и рассчитан на анаэростат емкостью 3,5 литра, вмещающий до 10 чашек Петри). По надежности создания анаэробных условий газогенераторные пакеты уступают вакуум-заместительному методу [3]. Это обусловлено тем, что для связывания кислорода расходуется двойное количество водорода, поэтому при использовании прототипа возможно временное создание отрицательного давления внутри анаэростата. В случае недостаточной герметичности анаэростата это может привести к подсосу воздуха и как следствие попаданию кислорода внутрь анаэростата, что категорически недопустимо во время культивирования анаэробных микроорганизмов [4, 5]. Другой причиной недостаточной надежности прототипа является низкий срок службы палладиевого катализатора. Рекомендуемый срок годности катализатора - 30 циклов анаэробного культивирования, однако нередки случаи выхода его из строя до истечения этого срока.

Поэтому новизной предлагаемого изобретения является способ, сочетающий физическое удаление кислорода с обогащением анаэробной атмосферы водородом и углекислым газом за счет химических реакций внутри анаэростата и позволяющий повысить скорость, надежность и снизить стоимость создания атмосферы, оптимальной для культивирования анаэробных микроорганизмов.

Существенным отличием способа является то, что удаление кислорода производят путем сочетания откачки воздуха и заполнения вакуума азотом с удалением остатка кислорода за счет его реакции с водородом на палладиевом катализаторе, водород получают в сосуде, закрытом воздухопроницаемой пробкой и размещенном внутри анаэробного культиватора из алюминия и водного раствора гидроокиси натрия.

За счет того, что удаление кислорода производят путем сочетания откачки из анаэростата воздуха и последующего заполнения вакуума азотом с удалением остатка кислорода с использованием его реакции с водородом на палладиевом катализаторе, достигается технический результат увеличения скорости создания бескислородной атмосферы. На процедуру физического удаления кислорода уходит 2-3 мин и удаляется 90-99% кислорода, т.е. его концентрация в анаэростате падает до 2-0,2%. Эта концентрация кислорода уже не вызывает быстрой гибели анаэробных микроорганизмов и даже позволяет культивировать их отдельные виды. Для удаления остаточного количества кислорода используется реакция водорода с кислородом на палладиевом катализаторе, поэтому по сравнению с прототипом, где эта реакция применяется для удаления всего кислорода, достигается технический результат увеличения скорости создания бескислородной атмосферы. Кроме того, этот двухэтапный способ удаления кислорода приводит к повышению надежности культивирования анаэробов: в случае неожиданного выхода из строя катализатора не происходит гибели бактерий и есть возможность продолжить культивирование анаэробов после повторной процедуры создания атмосферы с новым катализатором.

Для получения водорода внутри анаэробного культиватора вместо реакции взаимодействия борогидрида натрия с водой используют химическую реакцию взаимодействия алюминия с водным раствором гидроокиси натрия. Т.к. эта реакция протекает в обычных условиях, а стоимость алюминия и гидроокиси натрия значительно ниже, чем стоимость борогидрида натрия для получения такого же количества водорода, достигается снижение стоимости создания атмосферы для анаэробных микроорганизмов. Дополнительное снижение стоимости достигается за счет того, что большая доля кислорода удаляется вакуум-заместительным методом, поэтому в заявляемом способе требуется меньшее (по сравнению с прототипом) количество водорода.

Флакон, где происходит реакция взаимодействия алюминия с водным раствором гидроокиси натрия, закрывают ватно-марлевой пробкой. Известно, что гидроокись натрия способна вступать в реакцию с углекислым газом. Для предотвращения взаимной нейтрализации реагентов, а именно гидроокиси натрия, необходимой для получения водорода и углекислого газа, необходимого для роста анаэробных бактерий, в заявляемой методике флакон, где происходит реакция взаимодействия алюминия с водным раствором гидроокиси натрия, закрывают воздухопроницаемой ватно-марлевой пробкой. Благодаря этому во время реакции во флаконе создается небольшое избыточное давление, что препятствует проникновению CО₂ внутрь этого флакона.

Углекислый газ получают внутри анаэробного культиватора из гидрокарбоната натрия и лимонной кислоты, разобщенных до заполнения вакуума азотом за счет наклонения анаэробного культиватора и соединяющихся в результате его возвращения в горизонтальное положение. Для этого в чашку Петри с края компактной кучкой добавляют гидрокарбонат натрия, а с противоположного края - лимонную кислоту, после чего чашку осторожно помещают в анаэробный культиватор. Анаэробный культиватор слегка наклоняют так, чтобы один из ингредиентов оказался выше, а другой - ниже, и фиксируют в таком положении. После этого добавляют воду таким образом, чтобы смочился только один из ингредиентов. В результате этого реактивы оказываются разобщенными. После откачки воздуха и заполнения вакуума азотом анаэробный культиватор возвращают в исходное горизонтальное положение. В результате реактивы смешиваются и начинается выделение CO₂. Разобщение реактивов до заполнения вакуума необходимо для того, чтобы избежать потерь CО₂, т.к. известно, что реакция взаимодействия гидрокарбоната натрия с лимонной кислотой начинается немедленно и протекает очень бурно. Поэтому если не задержать начало реакции, большая часть углекислого газа будет потеряна во время откачки воздуха и состав атмосферы внутри анаэростата будет отличаться от оптимальной. Предотвращение выделения СО₂ до заполнения анаэростата азотом необходимо также для создания контролируемого избыточного давления внутри анаэростата (за счет продукции СО₂). В отличие от прототипа, где для предотвращения потерь углекислого газа используется фитиль из фильтровальной бумаги, сдерживающий на фиксированное время начало выделения СО₂, а также скорость этой реакции, разобщение реактивов за счет наклонения анаэростата позволяет точно синхронизировать время начала реакции с окончанием вакуум-заместительной процедуры удаления кислорода без последующего снижения скорости продукции CО₂. Высокая скорость продукции CО₂ внутри анаэростата в сочетании с низкой долей водорода, который расходуется на поглощение остатков кислорода (в заявляемом способе на это расходуется менее 30% водорода, в прототипе - около 78%), исключает создание разрежения внутри анаэростата и как следствие подсос кислорода, что приводит к дополнительному повышению надежности заявляемого способа.

Способ осуществляется следующим образом.

В анаэробный культиватор помещают лабораторную посуду с посевами.

На внутренней стороне крышки анаэробного культиватора закрепляют палладиевый катализатор.

В анаэробный культиватор помещают индикатор анаэробных условий.

В чашку Петри с края компактной кучкой добавляют 1,4 г гидрокарбоната натрия, а с противоположного края – 1 г лимонной кислоты, после чего чашку осторожно помещают в анаэробный культиватор.

Анаэробный культиватор слегка наклоняют таким образом, чтобы один из ингредиентов оказался выше, а другой - ниже, и фиксируют в таком положении. После этого добавляют 7 мл воды таким образом, чтобы смочился только один из ингредиентов.

Во флакон с 16 мл 5% раствора NaOH добавляют 0,5 г алюминия, флакон закрывают ватно-марлевой пробкой и немедленно помещают в анаэробный культиватор.

Анаэробный культиватор герметично закрывают крышкой и откачивают воздух до разрежения не менее - 0,9 атм, после чего производят его заполнение азотом.

Возвращают анаэробный культиватор в исходное горизонтальное положение.

Вышеописанная методика рассчитана на анаэробные культиваторы емкостью 3,5 л. Вместо азота возможно использование любого другого инертного газа.

Для получения такого же результата и при наличии баллона с углекислым газом способ можно осуществить следующим образом:

В анаэробный культиватор помещают лабораторную посуду с посевами.

На внутренней стороне крышки анаэробного культиватора закрепляют палладиевый катализатор.

В анаэробный культиватор помещают индикатор анаэробных условий.

Во флакон с 16 мл 5% раствора NaOH добавляют 0,5 г алюминия, флакон закрывают ватно-марлевой пробкой и немедленно помещают в анаэробный культиватор.

Анаэробный культиватор герметично закрывают крышкой и откачивают воздух до разрежения не менее 0,9 атм, после чего производят заполнение культиватора азотом до уровня показания манометра на отметке 0,1 атм, а затем - углекислым газом до достижения манометром нулевой отметки.

По сравнению с другими методами создания атмосферы, оптимальной для культивирования анаэробов, предлагаемый метод имеет самую низкую стоимость.

Так, стоимость создания атмосферы при использовании газогенераторных пакетов составляет около 2$, вакуум-заместительного метода - 0,5$, заявляемого способа - 0,2$.

По скорости и надежности создания анаэробных условий заявляемый способ не уступает вакуум заместительному методу и превосходит метод использования газогенераторных пакетов.

Сравнительная характеристика эффективности заявляемого метода и прототипа представлена в таблице.

Технический результат: способ позволяет повысить скорость, надежность и снизить стоимость создания атмосферы, оптимальной для культивирования анаэробных микроорганизмов.

Литература

1. Колесов А.П., Столбовой А.В., Кочеровец В.И. Анаэробные инфекции в хирургии. 1989 г. с.107.

2. Seip W.F., Evans G.L. Atmospheric analysis and redox potentials of culture media in the GasPak System. J Clin Microbiol. 1980 Mar; 11 (3); 226-33.

3. Imhof A., Heinzer I. Continuous monitoring of oxygen concentrations in several systems for cultivation of anaerobic bacteria. J Clin Microbiol. 1996 Jul; 34(7): 1646-8.

4. Miller P.H., Wiggs L.S., Miller J.M. Evaluation of AnaeroGen system for growth of anaerobic bacteria. J Clin Microbiol. 1995 Sep; 33(9):2388-91.

5. Van Horn K.G,. Warren K., Baccaglini E.J. Evaluation of the AnaeroPack system for growth of anaerobic bacteria. J Clin Microbiol. 1997 Aug; 35(8):2170-3.

6. Power D. A. and P. J. McCuen (ed.). 1988. Manual of BBL products and laboratory procedures, 6th ed. Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, Md.

7. Anaerobic Atmospheres. Available from URL:v http://www.bd.com/clinical/products/envir/anaatmo.asp.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в любых микробиологических лабораториях, проводящих работу с анаэробными микроорганизмами. Способ предусматривает сочетание физического метода удаления кислорода и заполнения вакуума азотом с удалением остатка кислорода за счет его реакции с водородом на палладиевом катализаторе. Для получения водорода используют химическую реакцию взаимодействия алюминия с водным раствором гидроокиси натрия, которую проводят в сосуде, закрытом воздухопроницаемой пробкой внутри анаэробного культиватора. Способ позволяет повысить скорость, надежность и снизить стоимость создания бескислородной атмосферы. 1 табл.

Способ создания бескислородной атмосферы, обогащенной водородом и углекислым газом, для культивирования анаэробных микроорганизмов, отличающийся тем, что удаление кислорода производят путем сочетания откачки воздуха и заполнения вакуума азотом с удалением остатка кислорода за счет его реакции с водородом на палладиевом катализаторе, водород получают в сосуде, закрытом воздухопроницаемой пробкой и размещенном внутри анаэробного культиватора, из алюминия и водного раствора гидроокиси натрия.