СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗАТА И ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ЭУКАРИОТОВ Российский патент 1994 года по МПК C12N5/00 C12P21/06 

Изобретение относится к биотехнологии, медицинской и биологической промышленности и касается усовершенствованного способа получения ферментативного гидролизата, а также питательной среды (ПС), предназначенной для выращивания клеток эукаритов-продуцентов биологически активных веществ (БАВ), диагностических и профилактических биологических и медицинских препаратов.

Известен способ получения ферментативного гидролизата отходов мясопереработки (ФГОМП) [2] путем мягкого гидролиза ферментными препаратами (медицинским панкреатином или гомогенатом поджелудочной железы свиньи) гомогената мышечных тканей плодов коров 4,5-5-месячного возраста и/или плодов свиней 2,5-3-месячного возраста, разведенного дистиллированной водой 1: 1,5. Процесс ведут при температуре 37-38^оС в щелочной зоне рН 7,6-7,8 в течение 6-7 сут. в присутствии хлороформа (3 об.%). Гидролиз прекращают прогреванием при температуре 90^оС 5-10 мин. При этом коагулируют и выпадают в осадок неразгидролизованные белки. Оставшиеся в надосадочной жидкости высокомолекулярные соединения осаждают в изоэлектрической точке белка. Надосадочную жидкость фильтруют и подвергают высушиванию в потоке горячего воздуха. Феpментативный гидролизат отходов мясопереработки используют в составе питательной среды при культивировании первично-трипсинизированных клеток животных. Однако описанный способ является трудоемким, поскольку предусматривает первоначальное отделение мышечной ткани плодов коров или свиней от костного скелета с последующей ее гомогенизацией.

Для культивирования различных гетероплоидных перевиваемых клеток животных и человека известны близкие по ростовым свойствам ПС на основе ФГОМП [1], ПС 199 [3].

ПС на основе ФГОМП имеет следующий состав, об.%:
Гидролизат плодов
коров 4-5-месячного
возраста и/или свиней 2,5-3-месячного возраста 0,4-0,5 Комплекс витаминов 0,0001
Сыворотка крови молод- няка северных оленей 4,0-6,000 Глутамин 0,025-0,035 Пролин 0,025-0,035 Тирозин 0,025-0,035
Солевой буферный раствор Хенкса Остальное
Данная питательная среда многокомпонента. Кроме того, количество имеющегося в наличии исходного сырья в настоящее время не может в достаточной степени обеспечить интенсивное развитие биотехнологии в стране.

Питательная среда 199 содержит более 6% компонентов, в том числе 20 аминокислот, 17 витаминов, коэнзимы, глюкозу, минеральные соли и некоторые другие вещества; среда полностью синтетическая. ПС 199 используется для длительного культивирования перевиваемых клеточных культур и обеспечивает высокую степень стандартности исследования. Недостатком является сложная технология ее изготовления из дорогостоящих, главным образом импортных реагентов. В условиях биотехнологического производства, где требуется большое количество питательной среды для получения клеточной биомассы, ПС 199 нерентабельна.

Целью изобретения является упрощение технологии процесса, снижение себестоимости конечного продукта и питательной среды на его основе для культивирования клеток эукариотов.

Это достигается тем, что в качестве белоксодержащего сырья используют обезжиренную, обезвоженную мозговую ткань крупного рогатого скота, разведенную дистиллированной водой в соотношении 1:25, которую подвергают обработке медицинским панкреатином или нативной поджелудочной железой свиньи в щелочной зоне рН 7,6-7,8 в присутствии хлороформа при температуре 37-38^оС в течение 6-7 сут. с последующим прогреванием при температуре 90^оС в течение 5-10 мин обработкой гидролизата 20-22%-ным раствором хлористого кальция в течение 5-10 мин, осаждением высокомолекулярных соединений в изоэлектрической точке белка, фильтрованием целевого продукта и его высушиванием.

Обезжиренная и обезвоженная мозговая ткань КРС является отходом производства медицинского препарата "Липоцеребрин" и имеет следующие стандартные параметры:
массовая доля белка составляет не менее 60%;
массовая доля жира не более 15%;
не содержит бактерий кишечной палочки и протея, а также патогенных микроорганизмов, в том числе сальмонелл.

Выпуск медицинского препарата "Липоцеребрин" обеспечивает стабильность получения больших количеств (тонны) белкового сырья для ферментативного гидролизата. Последнее дает возможность сделать безотходным производство медицинского препарата "Липоцеребрин", улучшив тем самым экологические условия его производства, и, кроме того, использовать белковое сырье в дальнейшем в качестве ферментативного гидролизата - основы питательной среды "Церебрат".

Питательная среда на основе ферментативного гидролизата обезжиренной, обезвоженной мозговой ткани крупного рогатого скота содержит следующие компоненты, об.%:
Ферментативный гидро-
лизат обезжиренной,
обезвоженной мозговой ткани КРС 0,15-0,20 Комплекс витаминов 0,0001-0,00012 Сыворотка крови КРС 5,0-10,0 Раствор Хенкса Остальное
В отличие от известной питательной среды 199 описываемая питательная среда содержит аминокислотную основу, полученную путем ферментативного гидролиза доступных полноценных белков, исключает необходимость внесения дорогостоящих импортных ингредиентов.

П р и м е р 1. Обезжиренную, обезвоженную мозговую ткань КРС, разведенную дистиллированной водой в соотношении 1:25, подвергают мягкому гидролизу ферментными препаратами (медицинский панкреатин или нативная поджелудочная железа свиньи). Процесс ведут при температуре 38^оС в щелочной зоне рН 7,6 в течение 6 сут в присутствии хлороформа (1,5 об.%). Гидролиз прекращают прогреванием при температуре 90^оС 5 мин. При этом коагулируют и выпадают в осадок неразгидролизованные белки. Оставшиеся в надосадочной жидкости высокомолекулярные соединения осаждают сначала в присутствии 20-22%-ного раствора хлористого кальция, а затем в изоэлектрической точке белка. Надосадочную жидкость фильтруют и подвергают высушиванию в потоке горячего воздуха методом распыления. Режим высушивания (на входе 150-160^оС и на выходе 95-100^оС) обеспечивает получение сухого препарата с остаточной влажностью не более 3-4%.

Полученный ферментативный гидролизат обезжиренной, обезвоженной мозговой ткани КРС имеет следующие физико-химические характеристики:
Показатели:
Концентрация водород- ных ионов 1%-ного раствора 6,2-7,0
Растворимость, % не менее 5,0
Массовая доля влаги, % не более 3,0-4,0
Массовая доля общего азота, % в пределах 10,0-11,0
Массовая доля амин- ного азота, % в пределах 5,5-6,0 Аминный коэффициент 0,55-0,60
Коэффициент протео- лиза 0,9-1,0
Качественный состав и количественное содержание аминокислот в 0,2%-ном растворе питательной среды с гидролизатом обезжиренной, обезвоженной мозговой ткани КРС ("Церебрат") в сравнении с составом питательной среды 199 и 0,5%-ным раствором гидролизата отходов мясопереработки - ФГОМП представлены в табл.1.

Строгое соблюдение условий гидролиза и регулярный контроль физико-химических параметров гидролизата в процессе позволяют получать в достаточной степени стандартный продукт, имеющий разброс количественных показателей аминокислот не более 5-6%.

П р и м е р 2. Подобрана концентрация ферментативного гидролизата обезжиренной, обезвоженной мозговой ткани КРС в составе питательной среды "Церебрат", обеспечивающая оптимальные условия жизнедеятельности перевиваемой линии клеток почки человека RH-PA. Результаты представлены в табл.2.

Из данных табл.2 следует, что оптимальные условия для роста и развития клеток обеспечивает ПС, содержащая 0,15-0,20 об.% ферментативного гидролиата обезжиренной, обезвоженной мозговой ткани КРС (что соответствует содержанию аминного азота 14-15 мг.%, соответственно содержанию аминного азота в ПС 199).

П р и м е р 3. Проводили испытание ростстимулирующих свойств ПС "Церебрат", дополненной СКРС в различных концентрациях, при культивировании гетероплоидных перевиваемых линий клеток почки человека RH-PA и СПЭВ в сравнении с ПС 199 производства ИПМ и ВЭ АМН СССР. Результаты представлены в табл. 3. Как видно из табл.3, оптимальной концентрацией СКРС является 5-10 об.%.

П р и м е р 4. Биологические ростовые свойства описываемой ПС испытывали при культивировании гетероплоидных перевиваемых линий клеток почки человека RH-PA и СПЭВ в сравнении с ПС 199 производства ИПМ и ВЭ АМН СССР и дополненной 5 об.% сыворотки КРС (табл.4). Из представленных в табл.4 данных следует, что ПС "Церебрат" (0,15-0,20 об.% ферментативного гидролизата на растворе Хенкса) с 5 об. % СКРС обладает ростстимулирующими свойствами, идентичными свойствами ПС 199 производства ИПМ и ВЭ АМН СССР.

Во всех последующих примерах приводится состав ПС "Церебрат" при следующем содержании компонентов, об.%: ФГ 0,15-0,2; СКРС 5; комплекс витаминов 0,0001-0,00012; раствор Хенкса остальное.

Исследована возможность применения ПС "Церебрат" при культивировании перевиваемой диплоидной линии фибробластов легкого эмбриона коровы (ЛЭК) при введении ее в состав ПС МЕМ в количестве 50 об.% (табл.5). Данные представленной таблицы иллюстрируют возможность применения питательной среды "Церебрат" в составе ПС МЕМ производства ИПМ и ВЭ АМН СССР при культивировании перевиваемых диплоидных линий клеток человека (М-19) и животных (ЛЭК).

П р и м е р 5 (см. табл.6).

Полученные данные свидетельствуют о том, что при длительном пассировании перевиваемой культуры клеток почки человека RH-PA ростстимулирующая активность ПС "Церебрат" аналогична активности в ПС 199.

П р и м е р 6.

Данные, представленные в табл. 7, свидетельствуют о том, что клетки, выращенные в ПС "Церебрат", сохраняют хорошую жизнеспособность и к 5 пассажу после замораживания полностью восстанавливают свои свойства.

Питательная среда "Церебрат" на основе полученного ферментативного гидролизата обезжиренной, обезвоженной мозговой ткани КРС обладает высокими ростстимулирующими способностями для некоторых первичных, а также перевиваемых гетероплоидных линий клеток животных и человека, что позволяет применять ее для получения больших количеств клеточной биомассы вместо многокомпонентной синтетической питательной среды 199.

Использование: биотехнология, медицина и биологическая промышленность. Сущность изобретения: обезжиренную, обезвоженную мозговую ткань крупного рогатого скота, являющуюся отходом производства медицинского препарата "Липоцеребрин", подвергают легкому ферментативному гидролизу медицинским панкреатином или гомогенатом поджелудочной железы свиньи, растворенным в воде в соотношении 1 : 25, при температуре 37 - 38°С в щелочной зоне рН 7,6 - 7,8 в течение 6 - 7 сут. в присутствии хлороформа с последующим прогреванием при температуре 90°С в течение 5 - 10 мин, осаждением из надосадочной жидкости высокомолекулярных соединений 20 - 22%-ным раствором хлористого кальция в течение 5 - 10 мин, затем в изоэлектрической точке белка, фильтрованием и высушиванием препарата. Полученный препарат - основа питательной среды "Церебрат" для культивирования клеток, содержащей компоненты, об.%: ферментативный гидролизат обезжиренной, обезвоженной мозговой ткани крупного рогатого скота 0,15 - 0,20; витамины 0,0001 - 0,00012; сыворотка крови животных 5 - 10; солевой буферный раствор Хенкса остальное. Полученный описываемым способом ферментативный гидролизат обезжиренной, обезвоженной мозговой ткани крупного рогатого скота - дешевый полноценный продукт, не требующий для своего изготовления дорогостоящего специального оборудования, обеспечивающий (в качестве основы питательной среды "Церебрат") стандартные условия культивирования клеток эукариотов, близкий в качественном и количественном отношении по аминокислотному составу питательной среды на основе ферментативного гидролизата отходов мясопереработки. 2 с.п.ф-лы, 7 табл.

1. Способ получения ферментативного гидролизата, включающий обработку белоксодержащего сырья, разведенного водой медицинским панкреатином или нативной поджелудочной железой свиньи, в щелочной зоне рН 7,6 - 7,8 в присутствии хлороформа при 37 - 38^oС в течение 6 - 7 сут, прогревание при 90^oС в течение 5 - 10 мин, последующее осаждение высокомолекулярных соединений в изоэлектрической точке белка, фильтрование целевого продукта и его высушивание, отличающийся тем, что, с целью упрощения технологии процесса и снижения себестоимости конечного продукта, в качестве белоксодержащего сырья используют обезжиренную, обезвоженную мозговую ткань крупного ротагого скота, фермент растворяют в воде в соотношении 1 : 25 и перед осаждением высокомолекулярных соединений проводят обработку гидролизата 20 - 22%-ным раствором хлористого кальция в течение 5 - 10 мин. 2. Питательная среда для культивирования клеток эукариотов, включающая аминокислотную основу, комплекс витаминов, раствор Хенкса и сыворотку крови крупного рогатого скота, отличающаяся тем, что, с целью снижения себестоимости, в качестве аминокислотной основы используют ферментативный гидролизат обезжиренной, обезвоженной мозговой ткани крупного рогатого скота при следующем соотношении компонентов, об.%:
Ферментативный гидролизат обезжиренной, обезвоженной мозговой ткани крупного рогатого скота 0,15 - 0,20
Комплекс витаминов 0,0001 - 0,00012
Сыворотка крови крупного ротагого скота 5 - 10
Раствор Хенкса Остальное