Маркер для люминесцентного иммуноанализа Советский патент 1992 года по МПК G01N33/532 C09B47/00 

3 1707

цивнта экстинкции (.000-200.000) в полосе Соре (380-420 нм).

Безметальные порфирины имеют время с затухания люминесценции в водных . растворах при комнатной температуре порядка 1-10 10 с.;.

В твердофазном иммуноанализе чувствительность определения иммунологичес- ких компонентов с помощью этих меток ю ограничивается уровнем Н и обусловлена тем, что эквивалентный уровень фонового сигнала дают примесиц рассеяный свет и собственно полисти-t- рольный планшет, в котором проводятся-15 эти измерения.. ,

Наиболее близким аналогом предлагаемого маркера для люминесцентного -. иммуноанализа является Pd-копропорфи- рин Этот реагент, по сравнению с без-20 метальными порфиринами, способен длительно люминесцировать-фосфоресциро- вать при комнатной температуре в водном растворе.

Для этого соединения характерно: 25 максимум возбуждения - 392 нм, максимум люминесценции (фосфоресценции) - 665 нм, в полосе возбуждения в водном растворе 6«188 400, полуширина в поло-: сах возбуждения и фосфоресценции 3 25 нм, время жизни фосфоресценции в водном растворе с сульфитом натрия ( (2 мг/мл) и 0,1% тритона Х-100 1,2 10-5с.

. 3 Конъюгаты с иммунологическими компонентами для Pd-комплексов порфиринов получают путем их.актнвапдш с использованием карбодиимидов и последующего связывания с аминогруппами иммунологи-4 ческнх компонентов.

Существование длительной люминесценции Pd-копропорфирина со временем затухания 1, позволяет исполь- зовать его в иммунолюминесцентном анализе с временным разрешением (ИЛАВР) р повысить чувствительность определения нммунологических компонентов до

ю- 2м. . г -. 5

Повышение чувствительности в ИЛАВР постигается за счет резкого снижения фона примесей и исключения влияния рассеянного света. Технически это 1 обеспечивается тем, что процесс регистрации люминесценции ведут раздельно во времени от акта возбуждения.

Для Pd-копропорфйрина время задержки между актом возбуждения люминесценции и началом регистрации фосфоресценции составляет 0,2 10(время, эквивалентное времени затухания фосфоресценции)

Гт- 1.

По сравнению с другими описанными ъ литературе металлепорфиринами, таки- ми как Zn-, A1-, Sn-, Pd-комплексы, предлагаемый более чем в 10 раз превосходит их по уровню интенсивности люминесценции.

Тем не менее, достигнутый предел детекции с помощью Pd-комплексов уступает хелатам с ионами Еи типа А-дикетонов.

Целью изобретения является повышение чувствительности люминесцентного иммуноанализа с временным разрешением с использованием маркеров класса ме- талЛопорфиринов, а также синтезсоеди- нения, которое обладало бы лучшими , люминесцентными свойствами по сравнению с известными маркерами.

Но ставленная задача решается синтезом по схеме соединения Pt-копропорфи рина III тетракислоты.

соосн

соосн.;

i

СН7

I L

СН2 К,Р1С14

C6H5CN

сн.

г- СООСН,

СООСНсн

соосн.

Н3С

сн,

I 2 СН2

соосн, соосн,

соон

Соединение (3) получают реакцией тетраметилового эфира копропорфирина с солью двухвалентной платины в бен- зонитриле, а затем омьшеннем платинового комплекса тетраметилового эфира действием 2Н едкого кали в тетрагидр фуране до платинового комплекса тетр кислоты копрэпорфирина.

Соединение (3) представляет собой игольчатые кристаллы (из хлороформа и метанола) оранжевого цвета, т.пл. 191-19 .°С, и характеризуется следую- пщми спектральными данными.

ИК-спектр (СНСЦ) , , 1720, ().

Электронный спектр, (CHCl) , А , ех1(Г3нм: 381,3 (285); 501,5 (12,3); 561,1 (50).

Элементный состав.

Найдено, %: С 53,14; Н 4,93; N 6,19.

C toH44N408Pt.. .

Пример 1. Платиновый комплек тетраметилового эфира копропорфирина III.

2АО мг порфирпна (I) растворяют в 50 мл бензоин грила. Топанляыт lot. мг (1,1 моль) хлороплатиннта калия (. ) и кипятят с обратным холодильником. Контроль за протеканием

0

0

5

0

5

реакции ведется спектрофотометрическг.. Через 8 ч добавляют erje 80 мг (055 моль) соли и продолжают нагревание до тех пор, пока в спектре не исчезнут полосы, характерные для спо- бодного основания порЛнрина. При -этом отношение полос oi/ft составляет 3-3,.. |Бензонитрил отгоняют при пониженном давлении. Остаток растворяют в хлоро- Лорме и хроматографируют на силикагеле АО/100 (Ц в системе хлороформ-мета- . нол (2:1). Отбирают фраюуно оранжево- го цвета, содержапую платиновый ком- .плекс (II). Дополнительную очистку проводят с помоцью препаративной тонкослойной хроматографии на окиси алюминия IV степени активности в хлоро- Лорие. Отделяют наиболее подвижную зону платинового комплекса, вещество : элюнруют с окиси смесью хло- роЛорм-э Ъир (5:2). Растворители упаривают досуха. Платиновый комплекс перекристаллизонмвают из смеси хлороформ-метанол, получая 174 мг (57%), т.пл. 191-192°С.

Электронный спектр (СНС1), С- ИГ им: 381,3 (285); 5-1,. (1Г..З), 536,1 (50).

ИК-спектр, (СНС,),Ј, сгГ( : 1720 (СООСН}).

ПНР-спектр (СПС13),б : 9,68 (с, Н); 9,67 (с, Н); 9,65 (с, Н); 9,63 (с. Н, . -мезо-Н); А,18 (8Н, т, СН СН СООСН); 3,66 (6Н, с, СН); 3,64 (6Я, с, СН3); 5 3,45 (6Н, с, СН,); 3,41 (6Н, с, СИ,); 3,17 (8Н,-т, СН СООСН,).

Масс-спектр, п/е, 7,: 905 (II®, 75);

904 (Н®, 100); 906 (М®, 65)j 832 (69); люминесценции конъюгаты с Pd-копропор- 831 (73); 830 (58), 759 (8); 758 (15); о фирином и близки к уровню люминесценции ионов Ем п усиливающем растворе фирмы LKR ШНаг.

ти 650-800 ни, соотношение уровня стандартного сигнала для fl 700 и 800 нм соответственно: 1; 0,4 п 01 отн. ед.

Из данных табл. 1 видно, что конъю- гатп белка с предлагаемым реагентом почти п 5 раз превосходят по уровню

757 (7); 686 (11); 685 (21); 684 (19); 613 (13); 612 (13); 611 (19), п 635,5 ().

Найдено, %: С 53,52; Н 5,04; Н 6,25.

C4oE4V4°8pt.

Вьгшслено, %: С 53,14; Н 4,93; N 6,19.

Приме р 2. Платиновый комплекс

В табл. . представлен сравнительные данные по чувствительности метода 15 ИЛЛВР с предлагаемыми метками на отечественном Ллуорнметре с временным разрешением (ВНИИ БП).

Условия регистрации для Pd-копро- порфирина и оптимизированы, а

тетракислоты копропорфирина III (III).20 Для Рс-копропорфнрина такой оптими170 мг платинового комплекса тетра- зации не проведено из-за конструктив- метилового эфира копропорфирина III них особенностей прибора - ограниче- (II) суспендируют в 15 мл тетрагидро- ние времени задержки строба уровнем фурана, добавляют 15 мл 2 М едкого ка- 0,125-КГЗс и времени регистрации лия и кипятят с обратным холодильни- 0,5«10 ком в течение 3 ч. Тетрагидрофуран упаривают в вакууме, оставшийся раствор разбавляют в 10 раз водой, фильтруют, ПОДКИСЛЯЮТ 1П%-НО1 СОЛЯНОЙ КИСЛОТОЙ до рН 4,0- Выпавший темно-крас- 30 ныл осадок (ill) отфильтровывают, промывают водой и супат в эксикаторе .над пятиокисью фосфора. Вес 155 мг (98%).

.Электронный спектр (NaHCO) Дмаце :i35 фицнент светимости (произведение кван- 365,5, 504,7, 536,3, (У ,|Ь,38.топого выхода на б(ЈС1) в полосе поЛюминесцентные характеристикиглопения) предлагаемого реагента на Pt-комплексов копропорфирннов 1,111 уровне (284- Ю3хО,6) 170,400, который тетракислотн представлены ниже: мак- превосходит коэффициент спетимости симум возбуждения 381 нм (6-IT 284);40 для ионов Eu i4 - соответственно максимум люминесценции (фоаЪоресцен- (30,000x0,7)21,000 и Pd-копро- ) 645 нм, полуширина максимума возбуждения 20 им, полуширина максимума фосфоресценции 21 нм, квантовый выход

с. Для Pt-копропорфирина оптимальными являются условия td (t задержки) О,05 с, tf, (t регистрации), .

.

Из данных табл. 2 видно, что предлагаемый реагент детектируется на уровне реагента фирмы 1,КВ ШНас с чувствительностью не менее 10 И.

Кроме того, учитывая высокий коэфпорфирина (184,000x0,2)36,000.

Таким образом, Pt-копропбрфирип III тетракислота обладает лучшими

люминесценции 0,6-0,7. Время с эату- 45 люминесцентными свойствами как мархання люминесценции (в е раз) 0,075 .

Условия регистрации: водньп раствор с 2 иг/мл сульфита и 0,1%-ный тритон Х-100, рН 7,4.

50

кер для люю несцентного анализа.

По сравнению с маркерами на основе ионов Ей предлагаешш нами реа- 1гент позволяет упростить иммуноана- лиз за счет исключения стадии, связа ной с переводом ионов Ей в люминес цируюпий комплекс, так называемым усилипаю тий раствор.

В табл. 1 представлены данные сравнительной оценки люминесцентных свойств конъюгатов антител с рлэличHi ot метками (10 II). Анализ проведен

cneXTpoAjTyopunorpe с временным ра-з-;5 ноанализе п качестве .гтюмшк гцкн иого

Ранением модели , rtuptni Perkin- гДтпег без корректен на чувствитель- по длинам полн. Чувствитпльность Олуорнметра заметно снижается п обласлюминесценции конъюгаты с Pd-копропор- фирином и близки к уровню люминесценти 650-800 ни, соотношение уровня стандартного сигнала для fl 700 и 800 нм соответственно: 1; 0,4 п 01 отн. ед.

Из данных табл. 1 видно, что конъю- гатп белка с предлагаемым реагентом почти п 5 раз превосходят по уровню

В табл. . представлен сравнительные данные по чувствительности метода ИЛЛВР с предлагаемыми метками на отечественном Ллуорнметре с временным разрешением (ВНИИ БП).

Условия регистрации для Pd-копро- порфирина и оптимизированы, а

зации не проведено из-за конструктив- них особенностей прибора - ограниче- ние времени задержки строба уровнем 0,125-КГЗс и времени регистрации 0,5«10

с. Для Pt-копропорфирина оптимальными являются условия td (t задержки) О,05 с, tf, (t регистрации), .

.

Из данных табл. 2 видно, что предлагаемый реагент детектируется на уровне реагента фирмы 1,КВ ШНас с чувствительностью не менее 10 И.

Кроме того, учитывая высокий коэфглопения) предлагаемого реагента на уровне (284- Ю3хО,6) 170,400, котор превосходит коэффициент спетимости для ионов Eu i4 - соответственно (30,000x0,7)21,000 и Pd-копро-

порфирина (184,000x0,2)36,000.

Таким образом, Pt-копропбрфирип III тетракислота обладает лучшими

0

кер для люю несцентного анализа.

По сравнению с маркерами на основе ионов Ей предлагаешш нами реа- 1гент позволяет упростить иммуноана- лиз за счет исключения стадии, связанной с переводом ионов Ей в люминес- цируюпий комплекс, так называемым усилипаю тий раствор.

Реаг« т найдет применение п иммумаркера антигенов и антител, которые входят составной частью в диагностические тест-системи для иммунных анализов.

Формула изобретения Pt-копропорфнрин III тетракислота формулыСООН

СООН СИ I

си.

Ч

СООН

СООН

Интенсив- ность, отн. ед. Максимальное воз- бужденге, нм

Максимальное излучение , нм

Время затухания

(), с -г------

Интенсивность люминесценции, тыс. имп. с, на приборе ВНИИ БП

я а

как маркер для люминесцентного анализа.

Таблица 1

1120

1200

381

340

645

615

0,075

.0,7

Табли. ца2