СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СМЕСИ АМИНОКИСЛОТ И НИЗШИХ ПЕПТИДОВ Российский патент 2006 года по МПК C12P13/06 A23J1/18 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения смеси аминокислот и низших пептидов из дрожжевых автолизатов.

В современных технологических процессах дрожжи используют в качестве сырья для получения различных продуктов, биологически активных веществ, аминокислот, нуклеиновых компонентов, витаминов и т.д. К числу известных способов переработки дрожжевой биомассы относится автолиз, осуществляемый собственными гидролитическими ферментами дрожжей.

Известны способы получения смеси аминокислот и низших пептидов путем автолиза дрожжей с последующей очисткой целевого продукта на ионитах (например, патент США №2272982, патент Великобритании №952713, авт. свидетельства СССР №602543, 957835, 1369300, 1731806).

В известных способах для извлечения, концентрирования и очистки аминокислотных смесей и низших пептидов из дрожжевых автолизатов используют сульфокатиониты и аниониты.

В известном способе по авторскому свидетельству №1731806 процесс выделения из дрожжевого автолизата смеси аминокислот и низших пептидов, аденина и тирозина строится исходя из расчетных режимов сорбции и десорбции этих продуктов на ионитах. Способ реализуется только в условиях точно воспроизводимого расчетного процесса с использованием 2-х ионитов: сульфокатионита КУ-2×8 и сильноосновного анионита типа АРА с получением целевого продукта, содержащего в аминокислотной смеси не менее 20-27% низших пептидов. Поскольку в условиях, реализуемых в известном изобретении, аминокислоты и пептиды не сорбируются анионитом АРА, наличие в целевом продукте большого количества пептидов обусловлено сорбционными свойствами сульфокатионита КУ-2×8.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения смесей амонокислот и низших пептидов из дрожжевого автолизата путем фильтрации автолизата через слабоосновный анионит ИА-1р с последующей сорбцией из фильтрата аминокислот и низших пептидов на сульфокатионите КУ-2×8, упариванием элюата и сушкой готового продукта (авт. свидетельство СССР №602543 - прототип заявляемого способа).

Существенными недостатками известного способа являются:

- высокое содержание в целевом продукте биологически активных пептидов, составляющих 24-30% от общего количества аминокислот, что обусловливает ограничение сферы использования продукта в качестве средства пищевого и фармакологического назначения, а также в виде аминокислотного компонента при создании микробиологических питательных сред и парфюмерных композиций;

- низкая объемная нагрузка автолизата V_(авт) на объем сульфокатионита КУ-2×8 V_{(катионита)} при максимальной объемной скорости сорбции V_{(авт/час)} аминокислот и низших пептидов сульфокатионитом после окончания автолиза, отделения клеточных оболочек, составляющих 45-50% от общего объема автолизата, и очистки автолизата на анионите ИА-1р:

V_(авт):V_{(катионита)}=0,8-1,0:1;

V_{(авт/час)}:V_{(катионита)}=0,3:1;

- значительный расход дистиллированной воды на промывку ионита КУ-2×8 после сорбции аминокислот и пептидов:

V_(воды):V_{(катионита)}=7,5-8,0:1,

- сульфокатионит КУ-2×8 одновременно с сорбцией аминокислот и пептидов практически полностью поглощает оставшиеся в автолизате после фильтрации через анионит ИА-1р растворимые балластные вещества, ответственные за пигментацию автолизатов, и при проведении десорбции аминокислот и пептидов с ионита КУ-2×8 1-3% раствором аммиака сорбированные балластные и красящие вещества попадают в элюат, что препятствует получению качественного целевого продукта.

Целью настоящего изобретения является создание эффективного и экономичного способа получения из дрожжевого автолизата высокоочищенной смеси аминокислот с низким содержанием пептидов.

Сущность предложенного способа получения смеси аминокислот и низших пептидов заключается в следующем.

Способ включает автолиз дрожжей, отделение клеточных оболочек центрифугированием и очистку автолизата на ионитах, при этом в качестве ионита используют гелевый сульфокатионит в водородной форме, содержащий в качестве сшивающего агента 12-16% дивинилбензола.

По предлагаемому способу дрожжевой автолизат после отделения клеточных оболочек подкисляют до рН=2,0-3,0, пропускают через сульфокатионит в водородной форме, содержащий в качестве сшивающего агента 12-16% дивинилбензола (далее ДВБ), промывают сульфокатионит подкисленной водой с рН=2-3 и сорбированную аминокислотную смесь элюируют 2-3% раствором аммиака, а элюат известным способом фильтруют через анионит, упаривают и сушат с получением целевого продукта.

В основу предлагаемого способа по разделению аминокислот и низших пептидов, содержащихся в дрожжевом автолизате, заложены современные представления о кинетико-диффузионных особенностях сорбции органических ионов на гелевых ионитах различной "плотности" (или проницаемости).

В предлагаемом изобретении использование слабо набухающих (К_(наб)=1,1-1,3) "плотных" сульфокатионитов с 12-16% ДВБ, позволило практически полностью отделить индивидуальные (свободные) аминокислоты от низших пептидов в одноактном процессе сорбции из автолизата. В условиях динамического колоночного процесса на таких сульфокатионитах происходит преимущественная сорбция индивидуальных аминокислот до исчерпания полной обменной емкости ионита. При этом поглощение низших пептидов существенно затруднено из-за кинетико-диффузионных ограничений, обусловленных пониженной проницаемостью "плотной" матрицы сорбента для органических ионов большего размера - в нашем случае пептидов. В то же время, поскольку в многокомпонентном по составу автолизате физико-химические свойства низших пептидов, в частности некоторых три- и дипептидов, мало отличаются от свойств отдельных аминокислот, имеет место незначительная сорбция пептидов на ионитах с 12-16% ДВБ.

В отличие от предлагаемого способа в прототипе, как и в известном способе по авт. свидетельству 1731806, при использовании гелевого сульфокатионита КУ-2×8 с 8% ДВБ, имеющего существенно менее "плотную" матрицу и К_(наб)=3,0, диффузия к сорбционным центрам катионита свободных аминокислот и низших пептидов, состоящих из 2-х, 3-х, 4-х или 5 аминокислот, проходит без видимых затруднений, и при десорбции эти пептиды вместе с индивидуальными аминокислотами попадают в целевой продукт, составляя 24-30% от общего количества аминокислотной смеси.

В этом принципиальное отличие предлагаемого способа от известного.

Существенными преимуществами предлагаемого способа по сравнению с известными являются:

- конечный продукт содержит не более 5-9% низших пептидов против 24-30% в известном способе;

- содержание свободных аминокислот в конечном продукте составляет не менее 90% по сравнению с 65-75% в известном способе;

- расширение сферы использования целевого продукта вследствие низкого содержания биологически активных пептидов в продукте;

- полученная смесь индивидуальных аминокислот и низших пептидов является высокоочищенным препаратом, так как использование сильно "сшитых" сульфокатионитов с 12-16% ДВБ существенно препятствует сорбции балластных веществ вследствие стерических и кинетико-диффузионных ограничений, в то время как сульфокатионит КУ-2х8 одновременно с сорбцией аминокислот практически полностью поглощает из автолизата растворимые балластные вещества, которые при десорбции попадают в готовый продукт;

- упрощение проведения технологического процесса, так как объемная нагрузка автолизата V_(авт) на объем сульфокатионита V_{(катионита)} с 12-16% ДВБ и объемная скорость сорбции V_{(авт/час)} смеси аминокислот и низших пептидов сульфокатионитом непосредственно из автолизата после отделения клеточных оболочек по сравнению с сульфокатионитом КУ-2х8 возрастают соответственно в 2,3-2,6 и в 3 раза;

V_(авт):V_{(катионита)}=2,3-2,6:1;

V_{(авт/час)}:V_{(катионита)}=1,0-1,2:1;

- уменьшение в 12-15 раз расхода дистиллированной воды на промывку сульфокатионита с 12-16% ДВБ по сравнению с промывкой ионита КУ-2×8 после сорбции аминокислот и пептидов в известном способе:

V_(воды):V_{(катионита)}=0,5-0,7:1.

Пример.

В простерилизованный реактор заливают 400 мл дистиллированной воды и загружают 2,0 кг свежих дрожжей влажностью 75%. Смесь нагревают до 48°С и при работающей мешалке выдерживают 30 часов. Полученную суспензию автолизата центрифугируют и после отделения нерастворимых клеточных оболочек супернатант подкисляют 5N раствором серной кислоты до рН=2,9 и подают на колонку (5×25 см) с сульфокатионитом в водородной форме с 12-16% ДВБ для сорбции аминокислот и пептидов. Оптическая плотность (ОП) "проскока" после колонки при 420 нм составляет 79-92% от оптической плотности исходного автолизата. После окончания сорбции ионит промывают 250-350 мл 0,002 N раствором серной кислоты и смесь аминокислот и низших пептидов десорбируют 2,5%-ным раствором аммиака. Далее известным способом элюат фильтруют через ионит, упаривают и сушат.

Аминокислотный состав целевого продукта и рабочие параметры осуществления предлагаемого изобретения представлены в таблицах 1 и 2 в примерах №№1, 2, 3. Для сравнения в примере №4 приведены соответствующие данные при использовании ионита КУ-2×8 для сорбции смеси аминокислот и пептидов из автолизата.

Таблица 1№ Пример №1Пример №2Пример №3Пример №4  ионит с 12% ДВЕионит с 13% ДВБионит с 16% ДВБИОНИТ КУ-2×8 Аминокислота (АК)целевой продуктцелевой продуктцелевой продуктцелевой продукт  гидролизов.*не гидролизов.**гидролизов.*не гидролизов.**гидролизов.*не гидролизов.**гидролизов.*не гидролизов.**  мг/гмг/гмг/гмг/г1Аргинин39,034,637,433,331,430,112,26,42Лизин98,189,2100,291,675,874,352,630.23Тирозин38,634,750,550,015,214,827,519,64Фенилаланин33,231,825,824,635,434,339,229,65Гистидин21,620,319,416,320,620,214,05,26Лейцин81,871,493,283,264,261,269,358,97Изолейцин52,350,958,558,250,045,545,933,58Метионин17,116,311,211,017,216,915,513,69Валин53,351,752,251,951.551,958,842,310Пролин29,227,230,029,225,725,342,821,411Треонин108,698,5133,0132,677,176,135,527,412Серин33,730,935,334,139,732,033,635,913Аланин88,286,4107,4102,678,477,573,463,514Глицин39,335,741.741,136,437,136,814,115Цистеин5,64,25,35,33,92,927,914,916Глютаминовая кислота67,261,665,660,560,952,576,056,117Аспарагиновая кислота50,637,649,432,245,842,863,661,218Триптофан5,32,90.10,15,44,900Всего в продукте862,7785,9916,2857,8734,2700,1724,6533,8Содержание в смеси АК и низших пептидов:        - свободные АК91,1 93,6 95,3 73,7 - низшие пептиды8,9 6,4 4,7 26,3 * - полное содержание аминокислот в гидролизованном продукте
** - содержание индивидуальных (свободных) аминокислот в продукте без гидролиза.

Таблица 2ПараметрыПример №1Пример №2Пример №3Пример №4 Ионит с 12% ДВБИонит с 13% ДВБИонит с 16% ДВБИонит КУ-2×8Объемная нагрузка, л/л2,6:12,5:12.3:10,9:1V_(автол):V_{(катионита)}    Объемная скорость сорбции, л/час:л1,2:11,1:11,0: 1,00,3:1V_(автол):V_{(катионита)}    ОП* "проскока" после сорбции по отношению к ОП автолизата, 420 нм, %79849219Расход воды на промыв. ионита после сорбции, л/л0,7:10,6: 10,5:17,5:1V_(воды):V_{(катионита)}    

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения смеси аминокислот и низших пептидов из дрожжевых автолизатов. Способ включает автолиз дрожжей, отделение клеточных оболочек центрифугированием и очистку автолизата на ионитах, при этом в качестве ионита используют гелевый сульфокатионит в водородной форме, содержащий в качестве сшивающего агента 12-16% дивинилбензола. Предлагаемый способ позволяет получить высокоочищенную смесь аминокислот с низким содержанием пептидов. 2 табл.

Способ получения смеси аминокислот и низших пептидов, включающий автолиз дрожжей, отделение клеточных оболочек центрифугированием и очистку автолизата на ионитах, отличающийся тем, что в качестве ионита используют гелевый сульфокатионит в водородной форме, содержащий в качестве сшивающего агента 12-16% дивинилбензола.