Способ получения смеси аминокислот, аденина и тирозина Советский патент 1992 года по МПК C12N1/06 C12N1/08 A23J1/18 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения смеси аминокислот, аденина и тирозина из дрожжей.

Цель изобретения - повышение полноты их извлечения.

Способ осуществляют следующим образом.

Суспензию прессованных дрожжей в деионизованной воде нагревают до 48 ± 1°С и перемешивают в течение 30 ч. Получают дрожжевой автолизат. Его пропускают через колонку с катионитом в Н+-фор- ме при значении критерия А аденина 2-4.

Колонку промывают серной кислотой и проводят элюирование раствором аммиака при том же значении критерия А аденина.

Критерий А определяет режим хрома- тографического процесса, включая в себя основные равновесные, кинетические и геометрические параметры хроматогра- фической системы. Его расчитывают по формуле

vj CJ

00 О О

А 3-(1 -а) Г

D-x

tf-u

где а - доля свободного объема в колонке между зернами сорбента;

Г - объемный равновесный коэффициент распределения;

х - высота слоя сорбента в колонке;

U - линейная скорость пропускания раствора в колонке над слоем сорбента;

D - коэффициент внутренней диффузии;

R - радиус набухшего зерна сорбента.

При Я 1 хроматографический процесс проходит в регулярном режиме и определяется в основном законами сорбци- онного равновесия. При Я 1 хроматографический процесс проходит в нерегулярном режиме, характеризуется неравновесным распределением вещества между фазами раствора и сорбента и не описывается законами равновесной сорбции.

При неравновесной фронтальной ионообменной сорбции многокомпонентных смесей не только изменяется сорбиру- емость отдельных компонентов, но и их соотношение не соответствует рассчитанному по константам обмена. При этом происходит существенное изменение состава сорбируемой смеси по сравнению с составом раствора, а также потери отдельных компонентов за счет их проскока через колонну.

При комплексной переработке биомассы дрожжей с получением нескольких ценных продуктов необходимо проводить хроматографические процессы при значении критерия Я 1 для всех целевых компонентов.

При значении критерия Я аденина 2-4 другие целевые компоненты автолизата также сорбируются в регулярном режиме. При меньших значениях критерия Я аденина происходят необратимые потери аденина, а также некоторых, в том числе незаменимых, аминокислот. Кроме того, при этом содержание компонентов нуклеиновых кислот в смеси аминокислот повышается выше допустимого предела.

Проведение хроматографических процессов при значении критерия Я аденина 4 нецелесообразно, так как это либо приводит к непроизводительным затратам времени вследствие снижения скорости пропускания раствора, либо за счет уменьшения зерна сорбента приводит к повышению гидравлического сопротивления колонны.

Элюат, полученный с катионита, пропу- скаютчерез колонку с высокоосновным ани- онитом в ОНГ-форме при значении критерия Я аденина 2-4 и промывают анионит раствором аммиака. Объединяют растворы, прошедшие через анионит при пропускании элюата и при промывании объединенный раствор высушивают и получают смесь аминокислот. Затем анионит промывают де- ионизованной водой и проводят элюирование раствором серной кислоты при значении критерия Я аденина 2-4. Элюат нейтрализуют, упаривают под вакуумом в 2-4 раза и выдерживают из него при охлаждении осадоктирозина. Тирозин отфильтровывают. Фильтрат пропускают через колонку с катионитом в NH4 -форме. Катио- нит промывают деионизованной водой и проводят элюирование раствором гидро- ксила натрия. Элюат нейтрализуют, упаривают в 2-4 раза, охлаждают и отделяют осадок аденина.

П р и м е р. В промытый простерилизо- ванный реактор заливают 250 мл деионизованной воды и загружают 1 кг свежих

прессованных дрожжей. Смесь выдерживают 30 ч при 48 ± 1°С, непрерывно перемешивая. Автолизат пропускают через колонну с катионитом КУ-2-8 в Н+-форме (5x30 см) при определенном значении критерия Я аденина . Колонну промывают 2 л 1 мМ раствора серной кислоты и проводят элюирование 2 л 1 н раствора аммиака при определенном значении критерия Я аденина. Полученный элюат подают на колонну

с высокоосновным анионитом АРА в форме (2,5x30 см) при определенном значении критерия Я аденина.

Анионит промывают 100 мл 1 н раствора

аммиака, который присоединяют к раствору, прошедшему через анионит. Обесцвеченный и освобожденный от компонентов нуклеиновых кислот раствор аминокислот высушивают на распылительной сушилке.

Колонну с анионитом промывают 100 мл деионизованной воды и проводят элюирование 1 л 1 н.раствора серной кислоты при определенном значении критерия Я аденина. Элюат нейтрализуют 25%-ным раствором аммиака до значения рН 7,0±0,5 и упаривают под вакуумом в 2-4 раза. Упаренный элюат охлаждают до 8-12°С и выдерживают в течение 10-12 ч при этой температуре. Осадок полупродукта отделяют фильтрацией, промывают деионизованной водой и переносят в реактор, содержащий 100 мл деионизованной воды. Полученную суспензию нагревают при перемешивании до 96-100°С, выдерживают

при этой температуре 10-15 мин и фильтруют. Фильтрат охлаждают до 8-12°С, подкисляют до рН 3,0-3,4 концентрированной серной кислотой и выдерживают при этой температуре 5-6 ч.

Осадок тирозина отделяют фильтрацией, промывают деионизованной водой и сушат. Фильтрат подают на колонну с катион итом КУ-2-8 в МНЦ+-форме (1x10 см) со скоростью 10 мл/ч. Колонну промывают 20 мл деионизованной воды и проводят элюи- рование 70 мл 1 н.раствора гидрооксида натрия. Элюат нейтрализуют концентрированной серной кислотой до рН 7,0±0,5 и упаривают под вакуумом в 2-4 раза. Упа- ренный раствор охлаждают до 5°С и выдерживают 10-12 ч. Кристаллы аденина отделяют фильтрацией, промывают деионизованной водой и сушат.

Аминокислотный анализ проводят на анализаторе Биотроник ЛЦ-5000 в системе натриевых буферов с погрешностью 2%.

Значения параметров, которые использованы при расчете критерия Я аденина, приведены в табл. 1. Расчет Я при а 0,3.

Использованные виды дрожжей указаны в табл.2.

В табл.3 приведены зависимости выхода смеси аминокислот, аденина и тирозина, а также аминокислотного состава смеси и содержания в ней компонентов нуклеиновых кислот от значения аденина при сорбции и десорбции на катионите и анионите.

Характеристика смеси аминокислот, аденина и тирозина приведена ниже.

Смесь аминокислот являет собою мелкодисперсный порошок белого или слабо-желтого цвета, гигроскопичен; растворимость - не менее 10% (в воде); рН 5% водного раствора 6,0-7,4, влажность - не более 10%, содержание негидролизованно- го белка (качественно) отсутствует; содержание аминокислот-70 ±15%;содержание низших пептидов не более 20%; содержание компонентов нуклеиновых кислот - не более 0,1%, содержание аммиака не более 0,2%; содержание углеводов не более 0,5%; содержание липидов не более 0,5%; зола не более 1,0%; содержание солей тяжелых металлов не более 0,001%.

Аденин являет собою белый или почти белый мелкокристаллический порошок; содержание аденина 99,5± 0,5%; ультрафиолетовый спектр раствора препарата в 0,1 н.соляной кислоте в области от 210 до 300 нм имеет единственный максимум поглощения при 261,5 нм и минимум при 228 нм. Отношение оптических плотностей вышеуказанного раствора; д250/д260 о,79;

Д280/Д260 03(); 0jo/o Hb|fl раствор про-

зрачен и неокрашен. Препарат хроматог- рафически гомогенен (ВЭЖХ на колонке

ЛиХросорб РП-18); зольность - не менее 0,05%; содержание тяжелых металлов менее 0,0005%.

Тирозин являет собою шелковистые иглоподобные кристаллы белого цвета; содержание тирозина в препарате 99±1 %; ультрафиолетовый спектр раствора препарата в 0,1 н.соляной кислоте в области от 210 до 300 нм имеет два максимума поглощения при 274 и 221 нм и минимум при 243 нм. Отношение оптических плотностей вышеуказанного рас- твооа: Д220/Д260 11,1; Д2&/Д270 0,80; д2бОуд270 0 66 препарат хроматографиче- ски гомогенен (ВЭЖХ на аминокислотном анализаторе Биотроник Л Ц 5001, в системе литиевых буферов); зольность менее 0,1 %; содержание тяжелых металлов менее 0,0005%.

Формула изобретения СпЬсоб получения смеси аминокислот, аденина и тирозина, включающий автолиз дрожжей путем нагревания дрожжевой суспензии при перемешивании, пропускание автолизата через катионит, промывание ка- тионита раствором серной кислоты, элюи- рование целевых продуктов, пропускание элюата через анионит, промывание аниони- та, элюирование и выделение целевых продуктов из элюата, отличающийся тем, что, с целью повышения полноты их извлечения, автолизат пропускают через колонку с катионитом в Н+-форме при значении критерия Я аденина 2-4, промывают катионит серной кислотой и элюируют раствором аммиака при том же значении критерия аденина, полученный элюат пропускают через колонку с высокоосновным анионитом в ОН -форме при значении критерия Я аденина 2-4, промывают анионит раствором аммиака, объединяют растворы, прошедшие через анионит при пропускании элюата и при промывании, и из объединенного раствора высушиванием выделяют смесь аминокислот, затем анионит промывают деионизованной водой и элюируют тирозин и аденин раствором серной кислоты при значении критерия Я аденина 2-4, элюат нейтрализуют, упаривают под вакуумом в 2-4 раза и из упаренного элюата при охлаждении выделяют осадок тирозина, его отфильтровывают, фильтрат пропускают через колонку с катионитом в ЫН4+-форме, катионит промывают деионизованной водой, элюируют аденин раствором гидроксида натрия, элюат нейтрализуют, упаривают под вакуумом в 2-4 раза, охлаждают и отделяют осадок аденина.

Таблица 1

Таблица2

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения смеси аминокислот, аденина и тирозина из дрожжей. Цель изобретения - повышение полноты их извлечения. Суспензию прессованных дрожжей в деионизованной воде нагревают при 48 ± 1°С в течение 30 ч при перемешивании. Полученный автолизат пропускают через колонку с катионитом КУ-2-8 в Н+-фор- ме при значении критерия А аденина 2-4. Колонку промывают 1 мМ серной кислотой и элюируют 1 М раствором аммиака при том же значении критерия А аденина. Элюат пропускают через колонку с высокоосновным анионитом в ОН -форме и промывают анионит 1 н.раствором аммиака. Объединяют растворы, прошедшие колонку при пропускании элюата и при промывании. Объединенный раствор высушивают и получают смесь аминокислот. Анионит промывают деионизованной водой и элюируют 1 н.раствором серной кислоты. Пропускание через анионит и элюирование с аниони- та проводят при А аденина 2-4. Из элюата выделяют тирозин. Фильтрат после отделения тирозина пропускают через колонку ка- тионита КУ-2-8 в МН/ -форме. Катионит промывают деионизованной водой и проводят элюирование 1 н.раствором гидроксида натрия, Из элюата выделяют аденин. 3 табл. Ё I

с.%:

0,250,300,30

0,300,00,35

12,313,112,5

0,20,20,2

0,2 С,2 0,2

Примечание. ft 3«

Выход аденина от абсолютно сухих дрожжей , ма с. %

Выход тирозина от абсолютно сухих дрожжей , ма с. %

Выход смеси аминокислот от абсолютно сухих дрожжей, масД

Содержание компоненто нуклеиновых кислот в смеси аминокислот,мае

Содержание отдельных аминокислот, % мл от суммы

Аспарагиновая кислота

Треонин Серии

Глутаминовая кислота

Пролин Глицин Алании

0,20 0,50 16,0 0,1

0,1

0,1

Таблица 3

Продолжение табл.3