НАБОР ТАБЛЕТИРОВАННОЙ ЖИВОЙ РЕКОМБИНАНТНОЙ ОРАЛЬНОЙ БИВАКЦИНЫ ПРОТИВ НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ И ГЕПАТИТА B И СПОСОБ ВАКЦИНАЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УКАЗАННОГО НАБОРА Российский патент 2007 года по МПК A61K39/285 A61K39/29 C12N15/79 A61P31/12 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для специфической профилактики натуральной оспы и вирусного гепатита В.

Известна живая рекомбинантная вакцина для профилактики гепатита В и натуральной оспы и способ вакцинации, включающий накожное применение указанной вакцины (патент РФ №2073524, МПК А61К 39/29; С12N 15/86, опубл. 20.02.97 г.). Вакцина содержит штамм рекомбинантного вируса осповакцины (ВОВ) ГКВ №2131 с титром (3-5)×10⁸ оспообразующих единиц (ООЕ) на мл, способного синтезировать preS2 и HbsAg вируса гепатита В, и пептон в качестве стабилизатора при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Штамм рекомбинантного ВОВ ГКВ №2131 с указанным титром90-95Пептон5-10

Недостатками известной вакцины и способа вакцинации является: низкая производительность при накожной вакцинации данным препаратом, необходимость квалифицированного медицинского персонала для проведения вакцинации, угроза «шприцевыми инфекциями» иммунодефицита, гепатитов и др. При вакцинации скарификационной вакциной также возможно выделение ВОВ в окружающую среду, что грозит неконтролируемой его передачей к непривитым людям с риском развития тяжелых осложнений.

Наиболее близким аналогом - прототипом вакцины является таблетированная живая рекомбинантная бивакцина против натуральной оспы и гепатита В на основе ВОВ для орального применения, содержащая в одной таблетке: 1. лиофилизированный вирусный материал, наработанный на основе рекомбинантного штамма ВОВ ГКВ №2131 с типичными свойствами ВОВ, экспрессирующего preS 2-Ag и HbsAg вируса гепатита В, с активностью 6,5-8,0 lg ООЕ на таблетку, 2. лактозу, 3. сахарозу, 4. стеарат кальция, 5. ванилин (патент РФ №2076735, МПК А61К 39/00; С12N 15/00, опубл. 10.04.97 г.).

Наиболее близким прототипом способа вакцинации является оральный способ однократного введения таблеток бивакцины. Иммунизирующая доза каждой таблетки одинакова (патент РФ №2076735, МПК А61К 39/00; С12N 15/00, опубл. 10.04.97 г.).

Известная вакцина и способы ее применения имеют 2 основных недостатка: при однократном применении таблеток с малой иммунизирующей дозой не достигается достаточный уровень иммунного ответа, а при однократном применении таблеток с большой иммунизирующей дозой возникают серьезные воспалительные процессы в верхних дыхательных путях, хотя при этом достигается приемлемый уровень сероконверсии к ВОВ: иммунная прослойка среди привитых достигает 90%. Кроме того, однократное применение этой вакцины даже в большой дозе вызывает формирование лишь кратковременного иммунитета к ВОВ (в течение 1-3 месяцев).

Техническим результатом предлагаемых изобретений является создание такого набора бивакцины против натуральной оспы и гепатита В и способа вакцинации с использованием указанного набора, которые обеспечили бы достаточный иммунный ответ в течение длительного времени (≥6 месяцев) без проявления побочного действия вакцины.

Указанный технический результат достигается тем, что набор таблетированной живой рекомбинантной бивакцины против натуральной оспы и гепатита В для орального применения согласно изобретению включает две таблетки, каждая из которых содержит стабилизирующие добавки, наполнитель и лиофилизированный живой вирусный материал, наработанный на основе рекомбинантного штамма ВОВ с типичными свойствами ВОВ, экспрессирующего белки preS2-S и HBs вируса гепатита В, иммунизирующая доза первой из которых составляет минимальное количество вирусного материала, достаточное для получения слабого иммунного ответа в организме при незначительной реактогенности, а иммунизирующая доза второй - максимальное количество вирусного материала, которое вызывает выраженный и длительно сохраняющийся иммунный ответ в организме без отрицательного побочного на него действия после введения первой таблетки бивакцины. Иммунизирующая доза первой таблетки составляет (0,5-7,0)×10⁶ ООЕ, а иммунизирующая доза второй таблетки - (1,0-5,0)×10⁷ ООЕ. Вирусный материал получен на основе рекомбинантного штамма ВОВ ГКВ №2131 на куриных эмбрионах (КЭ) или перевиваемой культуре клеток животных.

Причем первая и вторая таблетки вакцинного набора имеют разный цвет на поверхности и внутри.

Указанный технический результат достигается также тем, что в способе вакцинации таблетированной живой рекомбинантной бивакциной против натуральной оспы и гепатита В, включающем оральный прием таблеток бивакцины, согласно изобретению для вакцинации используют набор таблеток бивакцины по пп.1-3 настоящей формулы изобретения, причем вначале принимают первую таблетку с минимальной дозой бивакцины, а вторую таблетку с максимальной дозой бивакцины принимают до истечения времени формирования гуморального иммунного ответа (через 7-14 дней) после введения в организм первой таблетки с минимальной иммунизирующей дозой бивакцины.

Штамм рекомбинантного ВОВ ГКВ №2131 (b7,5S2-S) депонирован в государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского (патент РФ №1575576, С12N 15/00, опубл. 1994 г.).

Набор таблеток живой рекомбинантной бивакцины против натуральной оспы и гепатита В для орального применения содержит две плоские таблетки №1 и №2, расположенные в блистерной упаковке. Таблетки №1 и №2 имеют разный цвет снаружи и внутри, например желтый и серо-коричневый (для лучшего их различия). Иммунизирующая доза таблетки №1 составляет (0,5-7,0)×10⁶ ООЕ, а иммунизирующая доза таблетки №2 - (1,0-5,0)×10⁷ ООЕ. Таблетированная форма распадается в ротовой полости под действием влаги и температуры организма.

Пример 1. Способ получения живого вирусного материала

А. Получение вирусного материала на хорионаллантоисных оболочках куриных эмбрионов

Способ живого рекомбинантного вирусного материала включает в себя культивирование рекомбинантного ВОВ на хорионаллантоисных оболочках (ХАО) 12-13-суточных КЭ с последующим получением вируссодержащего материала в виде гомогената ХАО с 20% лактозы, который подвергают лиофильному высушиванию. Сухой вируссодержащий биопрепарат измельчают, смешивают с компонентами наполнителя и стабилизатора для приготовления таблеточной массы. Из последней путем прессования получают таблетки вакцины.

Б. Получение вирусного материала на перевиваемых клетках животных

Вначале была проведена проверка однородности вирусных материалов, полученных путем 10-кратного пассирования музейного штамма ГКВ №2131 (b7,5S2-S) на перевиваемых культурах клеток Vero и 4647. Для этого проведены исследования пассажного материала (5 и 10-й пассажи) путем анализа экспрессии HBs-антигена методом иммуноферментного анализа (ИФА) и наличие встройки pre-S2-S гена в вирусной ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Необходимость этих исследований диктуется требованиями производства препарата, когда количество пассажей производственного штамма на клеточных культурах-подуцентах может достигнуть 10. В результате этих исследований было отмечено, что пассажный материал (5 и 10-й пассажи на культурах клеток Vero и 4647) не содержит примесей ВОВ дикого типа и экспрессирует HBs-антиген на уровне 100-200 нг/10⁶ клеток. Это свидетельствует о высокой стабильности созданной генетической конструкции и открывает перспективы использования любой из испытанных культур клеток для производства бивакцины против натуральной оспы и гепатита В.

Для наработки вируссодержащего материала для последующего приготовления культуральной рекомбинантной бивакцины против натуральной оспы и гепатита В путем роллерного культивирования на бутылях объемом, например, 2 литра выращивают монослои перевиваемых культур клеток почки зеленой мартышки №4647 или VERO на ростовой питательной среде ДМЕМ с 10%-ной сывороткой крупного рогатого скота (КРС) или 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой. Использованную среду сливают и в роллерные бутыли заливают поддерживающую питательную среду ДМЕМ или Игла MEM с 2%-ной сывороткой КРС или 2%-ной эмбриональной телячьей сывороткой в количестве 200 мл на бутыль. Клетки инфицируют штаммом рекомбинантного ВОВ (ГКВ №2131 (b7,5S2-S) в дозе заражения - 1,0-100,0 БОЕ на клетку. Культивирование проводят при скорости вращения бутылей 3-12 оборотов в минуту до 50-70% цитопатического эффекта (при этом условии достигается наиболее высокая урожайность вируса). Данные о накоплении вирусного материала в культурах клеток приведены в таблице 1.

Таблица 1
Данные о накоплении штамма b7,5S2-S вируса осповакцины в культурах клеток 4647 и Vero при роллерном культивированииНомер экспериментаКонцентрация вируса в lg БОЕ/мл в культурах клеток (I₉₅=±0,5 lg БОЕ/мл)4647Vero17,07,027,57,337,57,547,36,8^*Примечание. (^*) - низкая плотность клеточного монослоя перед его инфицированием.

Далее поддерживающую питательную среду (200 мл в одной бутыли) заменяют на буферный раствор с объемом (20 мл), то есть в 10 раз меньшим. В качестве буферного раствора используют 0,01 М Tris для поддержания pH 8,8-9,0. Замена питательной среды на меньший по объему буфер (0,01 М Tris с pH 8,8-9,0) перед экстракцией вируса из животных клеток производится с целью снижения объема вирусной биомассы (при сохранении общего количества жизнеспособных вирусных частиц), что сокращает финансовые и временные затраты при проведении процесса последующей лиофилизации вирусного материала. Получение вируссодержащего материала осуществляют после замены питательной среды на буферный раствор путем экстракции вируса при трехкратном замораживании при температуре минус 20°С в течение не менее 5 часов и оттаивании клеточного монослоя при температуре плюс 20°С в течение не менее 1 часа. Далее полученную вируссодержащую суспензию отстаивают и отделяют целевую надосадочную фракцию с титром не менее 7,0 lg БОЕ/мл, в которую вводят стабилизирующие добавки: пептон, сахарозу и желатозу в конечной их концентрации в смеси (мас.%): 2,0-4,0; 2,0-3,0; 1,0-3,0 соответственно или мочевину, пептон, сахарозу и желатозу в конечной их концентрации в смеси (мас.%): 1,0-2,0; 2,0-4,0; 2,0-3,0; 1,0-3,0 соответственно. Полученную жидкую препаративную форму разливают в емкости, которые размещают в лиофильной установке типа СУПЕР-4. После проведения стандартной процедуры лиофилизации в препарате практически не снижается инфекционная вирусная активность, что свидетельствует о высокой устойчивости штамма b7,5S2-S BOB к лиофилизации в присутствии заявляемых стабилизирующих добавок. Далее сухой материал измельчают и смешивают с наполнителем.

Пример 2. Технология приготовления таблеток и их состав

Прессование в таблетки препарата производят на двенадцатипуансонном таблетпрессе модели К-VIII (Дрезден, Германия). Количество вируссодержащего материала в каждой таблетке закладывают столько, чтобы концентрация жизнеспособного вируса в них по расчетным данным, исходя из активности лиофильно высушенных материалов, находилась в расчетном диапазоне.

Ниже приведены примеры (а-г) составов таблеток №1 и №2 набора живой рекомбинантной бивакцины против натуральной оспы и гепатита В орального применения (в ротовой полости).

а) Таблетка №1 (желтого цвета)

Лиофилизированный материал с рекомбинантным штаммом ВОВ с активностью (7,6×10⁶ ООЕ) на таблетку2,04пептон0,12желатоза0,06сахароза10,10буфер0,001стеарат кальция2,0краситель Е 1040,02лактозаостальное до 100%

б) Таблетка №2 (серо-коричневого цвета)

Лиофилизированный материал с рекомбинантным штаммом ВОВ с активностью (3,9×10⁷ ООЕ) на таблетку7,20пептон0,38желатоза0,19сахароза10,29мочевина0,01буфер0,003стеарат кальция1,99ванилин0,20лактозаостальное до 100%

в) Таблетка №1 (желтого цвета)

Лиофилизированный материал с рекомбинантным штаммом ВОВ с активностью (1,6×10⁶ ООЕ) на таблетку1,04пептон1,20желатоза0,60сахароза10,85буфер0,009стеарат кальция1,97краситель Е 1040,02лактозаостальное до 100%

г) Таблетка №2 (серо-коричневого цвета)

Лиофилизированный материал с рекомбинантным штаммом ВОВ с активностью (1,5×10⁷ ООЕ) на таблетку10,13пептон3,80желатоза1,90сахароза11,55буфер0,027стеарат кальция1,94ванилин0,17лактозаостальное до 100%

Пример 3. Способ вакцинации с использованием заявляемого набора

При оральной иммунизации таблетку нужно разжевать и держать во рту до полного растворения не менее 2-3 минут, после чего в течение 30 минут не рекомендуется пить, курить и принимать пищу. Запрещается проглатывать таблетку. Процедура иммунизации проводится под контролем вакцинатора. Прием первой таблетки из заявляемого набора вызывает формирование минимального защитного уровня специфического иммунитета на ВОВ и маркер гепатита В. Через 7-14 дней (до истечения времени формирования гуморального иммунного ответа после введения в организм первой таблетки с минимальной иммунизирующей дозой) в организм орально вводят вторую таблетку из заявляемого набора с максимальной дозой бивакцины, после чего формируется устойчивый иммунитет к вирусам ВОВ и гепатита В.

Пример 4. Данные экспериментальных исследований на добровольцах заявляемого набора таблеток бивакцины и способа вакцинации, а также отдельно таблеток №1 и №2 с целью индукции гуморального иммунитета к вирусу натуральной оспы

Вакцина. Использовали набор из двух таблеток бивакцины оспы и гепатита В с иммунизирующей дозой (0,5-7,0)×10⁶ ООЕ (таблетка №1) и (1,0-5,0)×10⁷ ООЕ (таблетка №2), приготовленные в соответствии с ранее описанными примерами 1 и 2 и отдельно таблетка №1 и таблетка №2.

Пробы. От каждого добровольца ежедневно в течение 14 суток производили отбор слюны и мочи и один раз в неделю в течение 4 недель отбирали пробы плазмы и сыворотки для вирусологических и серологических исследований.

Серологические исследования. Сыворотки крови людей исследовали с целью определения уровня антител к вирусу ВОВ (штамм ЛИВП), HBs Ag. Титры антител к ВОВ оценивали в реакции нейтрализации (РН) по общепринятой методике [Справочник, 1967]. При этом за титр сыворотки принимали максимальное ее разведение, которое вызывало снижение количества ООЕ на ХАО более чем в два раза по сравнению с контролем. За рабочее разведение вируса принимали такое его разведение, которое при подсчете ООЕ на ХАО давало образование от 40 до 60 оспин. Аналогично оценивали титры антител к ВОВ в РН на культуре клеток 4647 по методу бляшек, который давал сходные результаты с таковыми, полученными с использованием КЭ. Общепринято, что защитные титры антител к ВОВ в сыворотке крови человека составляют ≥1:25.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку полученных результатов проводили общепринятыми методами [Ашмарин И.В., Воробьев А.А., 1962].

Для проведения экспериментальных исследований проводили подбор добровольцев, ранее вакцинированных против оспы.

Критериями отбора претендентов в добровольцы являлись: наличие или отсутствие оспенных вакцинальных знаков при визуальном осмотре и анамнестические данные (возраст претендентов, отсутствие заболевания вирусными гепатитами и вакцинации против гепатита В).

На основании предварительного медицинского обследования претендентов в добровольцы комиссия в составе: руководитель исследования, врач-терапевт, врач-стоматолог, врач-кардиолог, ЛОР-врач, врач-невропатолог, проводила отбор добровольцев, у которых не было выявлено соматических и других заболеваний, являющихся противопоказанием к проведению вакцинации.

По результатам проведенных серологических исследований на наличие маркеров гепатита В и антител к ВОВ были сформированы 8 групп добровольцев для проведения клинического испытания бивакцины «Ревакс-ВТ».

В группу 1 вошли 6 волонтеров, возраст - от 30 до 40 лет, имеющих оспенные знаки на плече. Эти добровольцы были иммунизированы в условиях отдаленной ревакцинации малой дозой (таблетка №1) бивакцины "Ревакс-ВТ".

В группу 2 вошли 10 волонтеров, средний возраст в группе - от 22 до 24 лет, имеющих оспенные знаки на плече. Добровольцы были иммунизированы в условиях отдаленной ревакцинации большой дозой (таблетка №2) бивакцины "Ревакс-ВТ".

Группа 3 представлена 8 волонтерами, средний возраст в группе - от 18 до 19 лет, не имеющими на плече оспенных знаков. Они были иммунизированы в условиях первичной вакцинации малой дозой (таблетка №1) бивакцины.

В группу 4 вошли 12 добровольцев, средний возраст - от 18 до 20 лет, не имеющих на плече оспенных знаков. Добровольцы были иммунизированы в условиях первичной вакцинации большой дозой (таблетка №2) бивакцины.

В группу 5 вошли 10 волонтеров, возраст в группе: 34-40 лет, имеющих оспенные знаки на плече. Эти добровольцы были иммунизированы малой дозой бивакцины "Ревакс-ВТ" (таблетка №1) и через 1 неделю большой дозой (таблетка №2).

В группу 6 вошли 10 волонтеров, возраст в группе: 31-38 лет, имеющих оспенные знаки на плече. Эти добровольцы были иммунизированы малой дозой бивакцины "Ревакс-ВТ" (таблетка №1) и через 2 недели большой дозой (таблетка №2).

В группу 7 вошли 11 волонтеров, возраст в группе: 28-34 года, имеющих оспенные знаки на плече. Эти добровольцы были иммунизированы малой дозой бивакцины "Ревакс-ВТ"(таблетка №1) и через 1 месяц большой дозой (таблетка №2).

В группу 8 вошли 4 волонтера, возраст в группе: 32-35 лет, имеющие оспенные знаки на плече. Они были иммунизированы малой дозой бивакцины "Ревакс-ВТ" (таблетка №1) и через 3-6 месяцев большой дозой (таблетка №2).

Обобщенные результаты проведенных исследований представлены в таблицах 2-4.

Анализ данных, приведенных в таблице 2, показал, что однократная иммунизация добровольцев малой дозой бивакцины "Ревакс-ВТ" (таблетка №1) не позволяет создать нужного уровня сероконверсии к ВОВ. Однократная же иммунизация большой дозой бивакцины (таблетка №2), создавая подходящий уровень сероконверсии к ВОВ - до 90%, дает сильные проявления реактогенности - до 50% процентов среди привитых волонтеров.

Вакцинация волонтеров, ранее привитых против оспы, сначала малой дозой бивакцины (таблетка №1) и через 7-14 дней большой дозой (таблетка №2) позволяет создать уровень сероконверсии к ВОВ до 100% при минимальных проявлениях реактогенности (таблица 3). Другим важным преимуществом предлагаемого нами набора и схемы вакцинации является продолжительность иммунного ответа к ВОВ: если при однократной вакцинации иммунная прослойка среди привитых волонтеров через 3 месяца уменьшается до 20%, то при двукратной вакцинации через 6 месяцев иммунная прослойка составляет 80% (таблица 4).

Нам не удалось достичь приемлемого уровня сероконверсии к HBsAg вируса гепатита В у привитых волонтеров. Однако дополнительная двукратная иммунизация коммерческой вакциной против гепатита В позволяет создать защитные уровни антител к HBsAg у людей, привитых по предложенной нами схеме вакцинации с применением предлагаемого набора, так как двукратная иммунизация людей с помощью данного набора уже создает базовый иммунитет к HBsAg (таблица 3).

Таблица 2
Результаты клинических испытаний оральной бивакцины при однократной вакцинации малой дозой (таблетка №1) или большой (таблетка №2) добровольцев групп 1 и 2, ранее привитых против оспы, и групп 3 и 4, ранее не привитых против оспыОцениваемый показательГруппа добровольцев1234Количество испытуемых1610812Иммунизирующая дозатаблетка №1таблетка №2таблетка №1таблетка №2¹Местные реакции в максимальном варианте:число2326выраженность²Слабая⁴Высокая⁴Высокая⁴Высокая¹Общие реакции в максимальном варианте:число3426выраженность³Слабая⁵Средняя⁵Средняя⁵Средняя⁶Наличие вируса в пробах в течение 14 суток наблюдения после вакцинации:слюнаОтсутствуетОтсутствуетОтсутствуетОтсутствуетплазмаОтсутствуетОтсутствуетОтсутствуетОтсутствуетмочаОтсутствуетОтсутствуетОтсутствуетОтсутствуетПроцент добровольцев, имеющих значимый гуморальный иммунный ответ на вирус (через 1 месяц после вакцинации):осповакцины31906383Примечания:
1 - общие и местные реакции имели место, как правило, в период с 7-х по 13-е сутки после вакцинации;
2 - легкая гиперемия зева, увеличение подчелюстных лимфоузлов до 0,8 см;
3 - повышение температуры тела до 37,2°С;
4 - гнойная ангина, увеличение подчелюстных лимфоузлов до 1,5 см;
5 - слабость, повышение температуры тела до 39,0°С;
6 - проводили исследование наличия ВОВ в пробах слюны, плазмы и мочи, взятых от добровольцев ежедневно в период с 1-х по 14-е сутки после вакцинации;

Таблица 3
Результаты клинических испытаний оральной бивакцины при двукратной вакцинации добровольцев, ранее привитых против оспы малой дозой (таблетка №1) и затем большой (таблетка №2)Оцениваемый показательГруппа добровольцев5678Количество испытуемых1010114Иммунизирующая дозатаблетка №1 и через 1 неделю таблетка №2таблетка №1 и через 2 недели таблетка №2таблетка №1 и через 1 месяц таблетка №2таблетка №1 и через 3-6 месяцев таблетка №2Введение малой дозы (первичная иммунизация)Местные реакции в максимальном варианте¹число2210выраженностьслабая²слабая²слабая²слабая²Общие реакции в максимальном варианте¹число2121выраженностьслабая³слабая³слабая³слабая³Введение большой дозы (вторичная иммунизация)Местные реакции в максимальном варианте:число0000Выраженность----Общие реакции в максимальном варианте:число0000выраженность    Наличие вируса в пробах в течение 14 суток наблюдения после вакцинации:слюнаОтсутствуетОтсутствуетОтсутствуетОтсутствуетплазмаОтсутствуетОтсутствуетОтсутствуетОтсутствуетмочаОтсутствуетОтсутствуетОтсутствуетОтсутствуетПроцент добровольцев, имеющих значимый гуморальный иммунный ответ на вирус:осповакцины10090,055,650Примечание:
1 - общие и местные реакции имели место, как правило, в период с 7-х по 13-е сутки после вакцинации;
2 - легкая гиперемия зева, увеличение подчелюстных лимфоузлов до 0,8 см;
3 - повышение температуры тела до 37,2°С.

Таблица 4
Сравнительные данные по динамике титров антител к вирусу осповакцины у добровольцев, орально привитых однократно малой дозой бивакцины (таблетка №1) или большой дозой (таблетка №2) и двукратно с интервалом 1-2 недели набором бивакциныНомер добровольцаТитр противооспенных вируснейтрализующих антител через различные сроки наблюдения:0 суток30 суток90 суток180 суток270 сутокОднократная вакцинация бивакциной в малой (таблетка №1) или большой дозе (таблетка №2) добровольцев, ранее иммуннизированных и не иммуннизированных против оспы^*761:51:1251:251:25 771:51:251:51:5 80<1:5>1:1251:1251:25 811:5>1:251:51:5 311:51:1251:5<1:5 35<1:5>1:25<1:5<1:5 14<1:51:25<1:5<1:5 15<1:51:125<1:5<1:5 17<1:51:1251:51:5 82<1:51:1251:5<1:5 Двукратная вакцинация набором бивакцины с интервалом в 1-2 недели^*11:51:1251:1251:125 21:51:51:251:5 3<1:51:1251:251:125 4<1:5>1:1251:125>1:125 51:51:251:251:25 61:51:251:251:125 7<1:51:251:25>1:125 8<1:51:251:251:125 91:51:125>1:1251:5 10<1:51:125>1:125<1:5 11<1:51:125  >1:12512<1:51:125  1:12513<1:51:125  1:12514<1:51:125  1:125Примечание:
^* - приведены данные по титрам антител к вирусу осповакцины только у добровольцев, наблюдавшихся в течение 6-9 месяцев.

Пример 5. Данные сравнительных экспериментальных исследований на добровольцах заявляемого набора таблеток бивакцины и способа вакцинации по индукции гуморального иммунитета к гепатиту В

Вакцины. В работе использовали две серии «Бивакцины оспы и гепатита В эмбриональной живой рекомбинантной, таблетки (Ревакс-ВТ)» №10 и №11 с концентрацией ВВ 3,9×107 и 7,6×106 ООЕ/таблетку соответственно, приготовленные согласно проекту ЭПР в соответствии ранее описанного метода (Патент РФ №2076735, 1997), прошедшие контроль качества согласно требованиям проекта ФСП в ОБТК ВЦ НИИМ МО РФ, ГНЦ ВБ «Вектор» и аттестованные в ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Для усиления иммунного ответа к HBsAg использовали коммерческую рекомбинантную дрожжевую жидкую вакцину против гепатита В «Комбиотех».

Пробы. От каждого добровольца один раз в месяц в течение 6 месяцев отбирали пробы плазмы и сыворотки серологических исследований.

Серологические исследования. Выявление антител к HBsAg, наличия HBsAg и антител к HBCor Ag в сыворотках крови людей регистрировали с помощью сертифицированных в МЗ России иммуноферментных тест-систем «Векто HBs Ag-антитела-стрип», с Ag «Рекоматгеп В-стрип» и «Векто HBCor-антитела-стрип» (производство ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирская область, п.Кольцове). Чувствительность последней тест-системы по ОСО ГИСК - 0,2 нг/мл. Общепринято, что защитные концентрации антител к HBsAg в сыворотках крови человека составляют ≥10 мМЕ/мл.

Обработка результатов испытаний. Статистическую обработку полученных результатов проводили общепринятыми методами [Ашмарин и Воробьев, 1962; Закс, 1976].

Для проведения экспериментальных исследований проводили подбор добровольцев, ранее вакцинированных против оспы.

Критериями отбора претендентов в добровольцы являлись: наличие или отсутствие оспенных вакцинальных знаков при визуальном осмотре и анамнестические данные (возраст претендентов, отсутствие заболевания вирусными гепатитами и вакцинации против гепатита В).

На основании предварительного медицинского обследования претендентов в добровольцы комиссия в составе: руководитель исследования, врач-терапевт, врач-стоматолог, врач-кардиолог, ЛОР-врач, врач-невропатолог, проводила отбор добровольцев, у которых не было выявлено соматических и других заболеваний, являющихся противопоказанием к проведению вакцинации.

По результатам проведенных серологических исследований на наличие маркеров гепатита В и антител к ВОВ были сформированы 2 группы добровольцев для проведения клинического испытания набора бивакцины «Ревакс-ВТ».

Группа 1 представлена 7 волонтерами (возраст от 22 до 44 лет). Эти добровольцы были двукратно иммунизированы рекомбинантной моновакциной «Комбиотех».

Группа 2 представлена 4 волонтерами (возраст от 37 до 45 лет), ранее вакцинированными против оспы и имеющими вакцинальные знаки. Эти добровольцы были иммунизированы в условиях отдаленной ревакцинации сначала рекомбинантной моновакциной «Комбиотех», через месяц дозой бивакцины 6,9 lg OOE) и еще через 1 месяц очень дозой 7,6 lg OOE.

Полученные результаты проведенных исследований представлены в таблицах 5 и 6.

Как видно из приведенных данных защитные титры антител к HBsAg отмечены у 40% добровольцев.

Из данных таблицы 6 видно, что защитные титры антител к ВВ - у 75,0% добровольцев, а защитные титры антител к HBsAg - у 100,0% добровольцев, причем следует отметить, что увеличение титров к HBsAg отмечалось после ревакцинации бивакциной.

Сравнивая результаты, представленные в таблицах 5 и 6, можно сделать вывод о том, что применение набора таблеток бивакцины после иммунизации вакциной против гепатита В позволяет существенно усилить иммунный ответ на HBsAg. Так если вторая иммунизация вакциной «Комбиотех» индуцирует иммунный ответ на HBsAg у 40% привитых волонтеров (у 3 из 7), то иммунизация с использованием набора таблеток бивакцины - у 100% привитых добровольцев (у 4 из 4). Необходимо отметить то, что в этом опыте была использована не самая удачная схема двукратной оральной иммунизации бивакциной: интервал между введениями доз бивакцины составил 1 месяц.

Таблица 5
Динамика гуморального иммунитета к HBsAg у добровольцев группы 1, иммунизированных двукратно вакциной «Комбиотех» в дозах по 20 мкгНомер добровольцаВозраст, годСутки после вакцинацииКонцентрация антител к HBsAg, мМЕ/мл60320<1030<1030Повторное введение вакцины «Комбиотех»60<10180<1071420<1030<10 Повторное введение вакцины «Комбиотех»60320018050090440<1030<1030Повторное введение вакцины «Комбиотех»60<1062310<102810060<1061320<1030<1030Повторное введение вакцины «Комбиотех»60<10180<1091240<1030<1030Повторное введение вакцины «Комбиотех»  60<10180<104220<1030<1030Повторное введение вакцины «Комбиотех»60500180<10

Таблица 6
Динамика гуморального иммунитета к ВВ и HBsAg у добровольцев группы 9, иммунизированных сначала вакциной «Комбиотех», через месяц дозой бивакцины 6,9 lg ООЕ и еще через месяц дозой бивакцины 7,6 lg OOE в условиях отдаленной ревакцинацииНомер добровольцаВозраст, годНаличие оспенных знаковСутки после вакцинацииТитр антител в РН к ВВКонцентрация антител к HBsAg, мМЕ/мл6437Есть0<1:5<100Иммунизация вакциной «Комбиотех»30--1030Иммунизация дозой бивакцины 6,9 lg OOE601:5˜1060Иммунизация дозой бивакцины 7,6 lg OOE901:251506537Есть0<1:5˜10 Иммунизация вакциной «Комбиотех»30-<1030Иммунизация дозой бивакцины 6,9 lg OOE60<1:5<1060Иммунизация дозой бивакцины 7,6 lg OOE901:25409943Есть0<1:5<10 Иммунизация вакциной «Комбиотех»30-<1030Иммунизация дозой бивакцины 6,9 lg OOE60<1:5<1060Иммунизация дозой бивакцины 7,6 lg OOE901:1253010345Есть0<1:5<10 Иммунизация вакциной «Комбиотех»   30-<1030Иммунизация дозой бивакцины 6,9 lg OOE60<1:550060Иммунизация дозой бивакцины 7,6 lg OOE901:5200

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для специфической профилактики натуральной оспы и вирусного гепатита В. Набор включает две таблетки, каждая из которых содержит стабилизирующие добавки, наполнитель и лиофилизированный живой вирусный материал, наработанный на основе рекомбинантного штамма ВОВ с типичными свойствами ВОВ, экспрессирующего белки preS2-S и HBs вируса гепатита В, иммунизирующая доза первой из которых составляет минимальное количество вирусного материала, достаточное для получения слабого иммунного ответа в организме при незначительной реактогенности, а иммунизирующая доза второй - максимальное количество вирусного материала, которое вызывает выраженный и длительно сохраняющийся иммунный ответ в организме без отрицательного побочного на него действия. Способ вакцинации включает использование набора таблеток бивакцины, в соответствии с которым вначале принимают первую таблетку с минимальной дозой бивакцины, а вторую таблетку с максимальной дозой бивакцины принимают до истечения времени формирования гуморального иммунного ответа (через 7-14 дней) после введения в организм первой таблетки с минимальной иммунизирующей дозой бивакцины. Преимущество изобретения заключается в создании стойкого иммунитета, 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 6 табл.

1. Набор таблетированной живой рекомбинантной бивакцины против натуральной оспы и гепатита В для орального применения, включающий две таблетки, содержащие стабилизирующие добавки, наполнитель и лиофилизированный живой вирусный материал, наработанный на основе рекомбинантного штамма вируса ВОВ с типичными свойствами вируса осповакцины, экспрессирующего preS 2-Ag и HbsAg вируса гепатита В, иммунизирующая доза первой из которых составляет (0,5-7,0)·10⁶ оспообразующих единиц (ООЕ) - минимальное количество вирусного материала, достаточное для получения базового иммунного ответа в организме, а иммунизирующая доза второй составляет (1,0-5,0)·10⁷ ООЕ, - максимальное количество вирусного материала, которое вызывает иммунный ответ в организме без отрицательного побочного на него действия после введения первой таблетки бивакцины, причем вирусный материал получен на основе рекомбинантного штамма вируса осповакцины ГКВ №2131 на куриных эмбрионах или перевиваемой культуре клеток животных.2. Набор по п.1, отличающийся тем, что первая и вторая таблетки набора имеют разный цвет.3. Способ вакцинации таблетированной живой рекомбинантной бивакциной против натуральной оспы и гепатита В, включающий оральный прием таблеток бивакцины, отличающийся тем, что для вакцинации используют набор таблеток бивакцины по пп.1 и 2 настоящей формулы изобретения, причем вначале принимают первую таблетку с минимальной дозой бивакцины, а вторую таблетку с максимальной дозой бивакцины принимают до истечения времени формирования гуморального иммунного ответа после введения в организм первой таблетки с минимальной иммунизирующей дозой.4. Способ по п.3, отличающийся тем, что вторую таблетку с максимальной дозой бивакцины принимают через 7-14 дней после приема первой таблетки с минимальной дозой бивакцины.