ТАБЛЕТИРОВАННАЯ ЖИВАЯ РЕКОМБИНАНТНАЯ БИВАКЦИНА "РЕВАКС ВКТ" ПРОТИВ НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ И ГЕПАТИТА В И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2004 года по МПК A61K39/12 A61P31/12 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для специфической профилактики инфекционного вирусного гепатита В и натуральной оспы.

Известна живая рекомбинантная вакцина для профилактики гепатита В и натуральной оспы для накожного применения (патент РФ №2073524, МПК А 61 К 39/29; С 12 N 15/86, опубл. 20.02.97 г.). Вакцина содержит штамм рекомбинантно-го вируса осповакцины (ВОВ) ГКВ №2131 с титром (3-5)×10⁸ ООЕ/мл, способного синтезировать preS2 и HbsAg вируса гепатита В и пептон в качестве стабилизатора при следующем соотношении компонентов, мас.%:

штамм рекомбинантного вируса оспо-

вакцины ГКВ №2131 с указанным титром 90-95

пептон 5-10

Недостатком известной вакцины является то, что в ней используют в качестве стабилизирующей добавки один пептон, что недостаточно обеспечивает сохранение активности вирусного материала в процессе его лиофилизации. Кроме того, низка производительность применения этого препарата при накожной вакцинации, необходимость квалифицированного медицинского персонала для проведения вакцинации, угроза инфицирования прививаемого пациента вирусами иммунодефицита, гепатитов и др. При вакцинации скарификацией возможно выделение вируса осповакцины в окружающую среду, что грозит неконтролируемой его передачей к непривитым людям с риском развития тяжелых осложнений.

Известен способ получения живой рекомбинантной вакцины для профилактики гепатита В и натуральной оспы для накожного применения, включающий пассирование рекомбинантного штамма ВОВ ГКВ №2131 двукратно на куриных эмбрионах и однократно на коже теленка, далее вируссодержащий материал накапливают на коже теленка и собирают путем соскоба образовавшихся оспин, гомогенизируют с фреоном, выделяют вирус центрифугированием в надосадочную жидкость, содержащую вирус с титром (3-5)×10⁸ ООЕ/мл, вносят 5-10 мас.% пептона, после чего полученную вакцину разливают в ампулы и лиофильно высушивают (патент РФ №2073524, МПК А 61 К 39/29; С 12 N 15/86, опубл. 20.02.97 г.).

Недостатком указанного способа является использование дорогостоящей и дефицитной биологической системы (продуцента) для наработки вируса (телята и развивающиеся куриные эмбрионы - РКЭ), параметры которой сложно стандартизировать и поддерживать. В России практически отсутствуют фермы по производству РКЭ в соответствии с международными стандартами, гарантирующие отсутствие посторонней микрофлоры в РКЭ и стандартные показатели развития эмбриона. Это в свою очередь приводит к браку в производстве вакцин, а также может отрицательно повлиять на ее свойства. Еще в большей степени эти недостатки проявляются при наработке вируса на телятах.

Наиболее близким аналогом-прототипом вакцины является таблетированная живая рекомбинантная бивакцина против натуральной оспы и гепатита В на основе вируса осповакцины для перорального применения, содержащая в одной таблетке, покрытой кислоустойчивой оболочкой, лиофилизированный вирусный материал, наработанный на основе рекомбинантного штамма ВОВ ГКВ №2131 с типичными свойствами вируса осповакцины, экспрессирующего preS 2-Ag и HbsAg вируса гепатита В с активностью 6,5-8,0 lg OOE на таблетку, лактозу, сахарозу, стеарат кальция и ванилин (патент РФ №2076735, МПК А 61 К 39/00; С 12 N 15/00, опубл. 10.04.97 г.).

Недостатком известной вакцины является то, что в ней используют в качестве стабилизирующей добавки одну лактозу, что недостаточно обеспечивает сохранение активности вирусного материала в процессе его лиофилизации и особенно таблетирования. Кроме того, активный вирусный материал нарабатывается на РКЭ, что не исключает содержание в препарате дополнительных примесей и его контаминацию посторонней микрофлорой, требует дополнительный биологический контроль.

Наиболее близким способом-прототипом получения таблетированной бивакцины против гепатита В и натуральной оспы является способ получения таблетированной живой рекомбинантной бивакцины против натуральной оспы и гепатита В, включающий пассирование рекомбинантного штамма ВОВ ГКВ №2131 на РКЭ, получение вируссодержащего материала с титром не менее 8,0 lg OOЕ/мл, его лиофилизацию со стабилизирующей добавкой, измельчение, смешивание с наполнителем, прессование и покрытие кислотоустойчивой оболочкой (патент РФ №2076735, МПК А 61 К 39/00; С 12 N 15/00, опубл. 10.04.97 г.).

Недостатком указанного способа-прототипа является использование дорогостоящей и дефицитной биологической системы (продуцента) для наработки вируса (РКЭ), параметры которой сложно стандартизировать и поддерживать. В России практически отсутствуют фермы по производству РКЭ в соответствии с международными стандартами, гарантирующие отсутствие посторонней микрофлоры в РКЭ и стандартные показатели развития эмбриона. Это в свою очередь приводит к браку в производстве вакцин, а также может отрицательно повлиять на ее свойства.

Техническим результатом предлагаемых изобретений является создание такой бивакцины против натуральной оспы и гепатита В и способа ее получения, которые позволили бы получить вируссодержащий материал в более концентрированном и очищенном виде, обеспечить сохранение активности этого вируссодержащего материала в процессе лиофилизации и таблетирования, снизить вероятность контаминации готового препарата посторонней микрофлорой, а также упростить технологию производства и обеспечить возможность стандартизации основных технологических этапов получения вакцины.

Указанный технический результат достигается тем, что в таблетированной живой рекомбинантной бивакцине против натуральной оспы и гепатита В на основе вируса осповакцины для перорального применения, содержащей в одной таблетке лиофилизированный вирусный материал, наработанный на основе рекомбинантного штамма ВОВ ГКВ №2131 с типичными свойствами ВОВ, экспрессирующего preS 2-Ag и HbsAg вируса гепатита В с активностью 6,5-8,0 lg ЦПД₅₀ на таблетку, лактозу, сахарозу, стеарат кальция и ванилин, согласно изобретению, вакцина дополнительно содержит пептон, желатозу и буфер, а ВОВ наработан на перевиваемых культурах клеток животных при следующем соотношении компонентов на одну таблетку, мас.%:

лиофилизированный вирусный

материал осповакцины с активностью

6,5-8,0 lg ЦПД₅₀ на таблетку 1,04-31,3

пептон 0,12-3,8

желатоза 0,06-1,9

сахароза 10,1-11,55

буфер 0,001-0,027

стеарат кальция 1,94-2,0

ванилин 0,17-0,2

лактоза остальное до 100%

Бивакцина дополнительно может содержать мочевину в количестве 0,01-0,2 мас.%.

Указанный технический результат достигается также тем, что в способе получения таблетированной живой рекомбинантной бивакцины против натуральной оспы и гепатита В, включающем пассирование рекомбинантного штамма ВОВ ГКВ №2131 в биологической системе для культивирования вирусов, получение вируссодержащего материала с титром не менее 8,0 lg ЦПД₅₀/мл, его лиофилизацию со стабилизирующими добавкой, измельчение, смешивание с наполнителем, прессование, согласно изобретению в качестве биологической системы для культивирования вируса используют перевиваемую культуру клеток животных с дозой заражения вирусом осповакцины не более 1,0 ЦПД₅₀ на клетку, наработку вируса осуществляют на монослое указанных клеток животных в роллерах на питательной среде до 50%-ного цитопатического действия (ЦПД) с последующей заменой этой среды на буферный раствор с объемом, меньшим, чем объем питательной среды; получение вируссодержащего материала осуществляют после замены питательной среды на буферный раствор путем экстракции вируса при трехкратном замораживании и оттаивании клеточного монослоя, а в качестве стабилизирующих добавок при лиофильном высушивании используют пептон, сахарозу и желатозу в конечной их концентрации в смеси, мас.%: 2,0-4,0; 2,0-3,0; 1,0-3,0 соответственно.

В качестве перевиваемой культуры клеток животных используют клетки почки зеленой мартышки №4647 или VERO, в качестве питательной среды для наработки вируса - среду ДМЕМ или Игла MEM с 2%-ной сывороткой крупного рогатого скота или 2%-ной эмбриональной телячьей сывороткой, в качестве буферного раствора используют 0,01 М Tris, pH 8, а при смене питательной среды на буферный раствор объем его уменьшают не менее чем в 10 раз.

В качестве дополнительного компонента стабилизирующей добавки при лиофильном высушивании бивакцины используют мочевину в конечной концентрации в смеси 1,0-2,0 мас.%.

Ниже приведены примеры 1-4 составов таблетированной живой рекомби-нантной бивакцины против натуральной оспы и гепатита В.

Пример 1.

лиофилизированный вирусный материал

осповакцины с активностью 6,5 lg

ЦПД₅₀ на таблетку 1,04

пептон 0,12

желатоза 0,06

сахароза 10,10

мочевина 0,20

буфер 0,001

стеарат кальция 2,0

ванилин 0,20

лактоза остальное до 100%

Пример 2.

лиофилизированный вирусный материал

осповакцины с активностью 7,0 lg

ЦПД₅₀ на таблетку 3,20

пептон 0,38

желатоза 0,19

сахароза 10,29

мочевина 0,01

буфер 0,003

стеарат кальция 1,99

ванилин 0,2

лактоза остальное до 100%

Пример 3.

лиофилизированный вирусный материал

осповакцины с активностью 7,5

lg ЦПД₅₀ на таблетку 10,40

пептон 1,20

желатоза 0,60

сахароза 10,85

буфер 0,009

стеарат кальция 1,97

ванилин 0,19

лактоза остальное до 100%

Пример 4.

лиофилизированный вирусный материал

осповакцины с активностью 8,0 lg

ЦПД₅₀ на таблетку 31,30

пептон 3,80

желатоза 1,90

сахароза 11,55

буфер 0,027

стеарат кальция 1,94

ванилин 0,17

лактоза остальное до 100%

Рекомбинантный штамм ВОВ ГКВ №2131 (b7,5S2-S BOB) депонирован в государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского (патент РФ №1575576, С 12 N 15/00, опубл. 1994 г.).

Желатоза - частично гидролизованный желатин - компонент стабилизатора; мочевина - хелатирующий агент, компонент стабилизатора. Лактоза (ТУ 6-09-2293-77), стабилизатор и наполнитель; сахароза (ГОСТ 5833-75), стабилизатор и органолептик; стеарат кальция (ТУ 6-09-4233-76) - скользящая добавка; ванилин (ГОСТ 16599-71), органолептик.

Пример 5. Способ получения таблетированной живой рекомбинантной бивакцины "Ревакс ВКТ"

Вначале проведена проверка однородности вирусных материалов, полученных путем 10-кратного пассирования музейного штамма ГКВ №2131 (b7,5S2-S BOB) на перевиваемых культурах клеток Vero и 4647. Для этого проведены исследования пассажного материала (5 и 10-й пассажи) путем анализа экспрессии HBs-антигена - методом ИФА и наличия встройки pre-S2-S гена в вирусной ДНК - методом ПЦР. Необходимость этих исследований диктуется требованиями производства препарата, когда количество пассажей производственного штамма на клеточных культурах-продуцентах может достигнуть 10. В результате этих исследований было отмечено, что пассажный материал (5 и 10-й пассажи на культурах клеток Vero и 4647) не содержат примесей ВОВ дикого типа и экспрессирует HBs-антиген на уровне 100-200 нг/10⁶ клеток. Это свидетельствует о высокой стабильности созданной генетической конструкции и открывает перспективы использования любой из испытанных культур клеток для производства бивакцины против натуральной оспы и гепатита В.

После этого выращивают монослои перевиваемых культур клеток почки зеленой мартышки №4647 или VERO на питательной среде ДМЕМ или Игла MEM с 10%-ной КРС или 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой в роллерных бутылях объемом, например, 2 литра. Использованную ростовую среду сливают и клеточный монослой заливают поддерживающей питательной средой ДМЕМ или Игла MEM с 2%-ной сывороткой КРС или 2%-ной эмбриональной телячьей сывороткой в количестве 200 мл на бутыль. Клетки инфицируют рекомбинантным штаммом ВОВ ГКВ №2131 (b7,5S2-S BOB) с дозой заражения не более 1,0 ЦПД₅₀ на клетку. Культивирование проводят при скорости вращения бутылей 3-12 оборота в минуту до 50% ЦПД (при этом условии достигается наиболее высокая урожайность вируса). Ниже в таблице 1 приведены результаты культивирования.

Далее питательную среду (200 мл в одной бутыли) заменяют на буферный раствор с объемом (20 мл), т.е. в 10 раз меньшим, чем объем питательной среды. В качестве буферного раствора используют 0,01 М Tris для поддержания рН 8. Замена питательной среды на меньший по объему буфер (0,01М Tris с рН 8,0) перед экстракцией вируса из животных клеток производится с целью снижения объема вирусной биомассы (при сохранении общего количества жизнеспособных вирусных частиц), что сокращает финансовые и временные затраты при проведении процесса последующей лиофилизации вирусного материала. Получение вируссодержащего материала осуществляют после замены питательной среды на буферный раствор путем экстракции вируса при трехкратном замораживании при температуре минус 20°С в течение не менее 5 часов и оттаивании клеточного монослоя при температуре плюс 20°С в течение не менее 1 часа. Далее полученную вируссодержащую суспензию отстаивают и отделяют целевую надосадочную фракцию с титром не менее 8,0 lg ЦПД₅₀/мл, в которую вводят стабилизирующие добавки: пептон, сахарозу и желатозу в конечной их концентрации в смеси, мас.%: 2,0-4,0; 2,0-3,0; 1,0-3,0 соответственно или мочевину, пептон, сахарозу и желатозу в конечной их концентрации в смеси, мас.%: 1,0-2,0; 2,0-4,0; 2,0-3,0; 1,0-3,0 соответственно. Полученную жидкую препаративную форму разливают в емкости, которые размещают в лиофильной установке типа СУПЕР-4. После проведения стандартной процедуры лиофилизации в препарате практически не снижается инфекционная вирусная активность, что свидетельствует о высокой устойчивости штамма b7,5S2-S BOB к лиофилизации в присутствии заявляемых стабилизирующих добавок. Далее сухой материал измельчают и смешивают с наполнителем. Ниже в таблице 2 приведен рецептурный состав таблеток с разной активностью вакцинного материала (в соответствии с примерами 1-4).

Прессование в таблетки препарата производят на двенадцатипуансонном таблетпрессе модели К-VIII (Дрезден, Германия). Количество вируссодержащего материала в каждой таблетке закладывают столько, чтобы концентрация жизнеспособного вируса в них по расчетным данным исходя из активности лиофильно высушенных материалов находилась в диапазоне от 6,5 до 8,0 lg ЦПД₅₀/таблетку.

Пример 6. Данные по исследованию активности таблетированной формы бивакцины "Ревакс ВКТ"

Экспериментальные исследования активности полученных таблеток показали, что в процессе приготовления таблеток бивакцины “Ревакс ВКТ” на базе лиофилизированного вирусного материала в присутствии стабилизирующей добавки не наблюдалось достоверной инактивация вирусного компонента. Расчетные данные по концентрации вируса в таблетках совпали с результатами раститровок вируса в таблетках: 7,2; 7,2; 7,2; 7,0 lg ЦПД₅₀/таблетку, а сама таблетированная форма соответствовала по своим физико-биологическим свойствам всем требованиям, предъявляемым к таким препаратам, что следует из приведенной ниже таблицы 3.

Пример 7. Данные по оценке реактогенности субстанции заявляемой бивакцины "Ревакс ВКТ"

Для оценки реактогенности субстанции заявляемой бивакцины была изучена динамика развития инфильтратов у кроликов, вакцинированных внутрикожно субстанциями штаммов вируса вакцины, полученными разными способами:

- на основе заявляемого способа (при культивировании штамма ГКВ №2131 BOB на культурах клеток);

- на основе способа-прототипа (при культивировании штамма ГКВ №2131 BOB на РКЭ);

- на основе способа-прототипа (при культивировании родительского штамма Л-ИВП на РКЭ);

Данные приведены ниже в таблице 4.

Животных инфицировали по методу Гротта. Максимальное развитие инфильтрата у кроликов наблюдалось на 4-е сутки после вакцинации в месте введения 5 lg ООЕ/0,1 мл и 4 lg ООЕ/0,1 мл штаммов b7,5S2-S эмбрионального и Л-ИВП. Причем появление же инфильтратов в обоих случаях было зарегистрировано на вторые сутки после инфицирования. При этом наименьшие по площади инфильтраты образовывались при введении штамма b7,5S2-S эмбрионального (Р<0,05) по сравнению со штаммам Л-ИВП. В то же время внутрикожное введение кроликам 5 lg TЦД₅₀/0,1 мл и 4 lg ТЦД₅₀/0,1 мл штамма b7,5S2-S культурального приводило к появлению инфильтратов на месте введения лишь на 7-е сутки с максимумом по площади на 8-е сутки. Кроме того, размеры этих инфильтратов были достоверно меньшими (Р<0,05) по сравнению даже с таковыми для штамма b7,5S2-S эмбрионального.

Полученные результаты свидетельствуют, что рекомбинантный штамм b7,5S2-S культурального происхождения обладает достоверно более низкой реак-тогенностью по сравнению с таковым эмбрионального происхождения.

Таким образом, заявляемая таблетированная бивакцина "Ревакс ВКТ", наработанная на перевиваемых культурах клеток животных, и способ ее получения по сравнению с такой же таблетированной формой вакцины "Ревакс ВТ", наработанной на РКЭ, менее реактогенна, так как содержит меньше посторонних примесей, не контаминируется посторонней микрофлорой, более технологична при изготовлении в промышленных масштабах.

Изобретение относится к области биотехнологии. Бивакцина содержит в одной таблетке лиофилизированный вирусный материал, наработанный на основе рекомбинантного штамма вируса осповакцины ГКВ № 2131 с типичными свойствами вируса осповакцины, экспрессирующего preS2-Ag и HbsAg вируса гепатита В с активностью 6,5-8,0 lg ЦПД₅₀ на таблетку, лактозу, сахарозу, стеарат кальция и ванилин, пептон, желатозу и буфер. Вирус осповакцины наработан на перевиваемых культурах клеток, животных при следующем соотношении компонентов на одну таблетку мас.%: лиофилизированный вирусный материал осповакцины с активностью 6,5-8,0 lg ЦПД₅₀ на таблетку 1,04-31,3; пептон 0,12-3,8; желатоза 0,06-1,9; сахароза 10,1-11,55; буфер 0,001-0,027; стеарат кальция 1,94-2,0; ванилин 0,17-0,2; лактоза - остальное до 100%. Способ получения бивакцины включает пассирование штамма рекомбинантного вируса осповакцины ГКВ №2131 в биологической системе для культивирования вирусов, получение вируссодержащего материала с титром не менее 8,0 lg ЦПД₅₀/мл, его лиофилизацию со стабилизирующими добавками, измельчение, смешивание с наполнителем, прессование. В качестве биологической системы для культивирования вируса используют перевиваемую культуру клеток животных 4647 или VERO с дозой заражения рекомбинантным штаммом вируса осповакцины не более 1,0 ЦПД₅₀ на клетку. Наработку вируса осуществляют на монослое указанных клеток животных в роллерах на питательной среде до 50%-го цитопатического действия (ЦПД) с последующей заменой этой среды на буферный раствор с объемом меньшим, чем объем питательной среды. Получение вируссодержащего материала осуществляют после замены питательной среды на буферный раствор путем экстракции вируса при трехкратном замораживании и оттаивании клеточного монослоя. В качестве стабилизирующих добавок при лиофильном высушивании используют пептон, сахарозу и желатозу в конечной их концентрации в смеси, мас.%: 2,0-4,0; 2,0-3,0; 1,0-3,0 соответственно. Вакцина сохраняет свою активность в процессе сушки и таблетирования, содержит меньше посторонних примесей. Способ ее получения более технологичен, 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Таблетированная живая рекомбинантная бивакцина против натуральной оспы и гепатита В на основе вируса осповакцины для перорального применения, содержащая в одной таблетке, лиофилизированный вирусный материал, наработанный на основе рекомбинантного штамма вируса осповакцины ГКВ № 2131 с типичными свойствами вируса осповакцины, экспрессирующего preS2-Ag и HbsAg вируса гепатита В, с активностью 6,5-8,0 lg ЦПД₅₀ на таблетку, лактозу, сахарозу, стеарат кальция и ванилин, отличающаяся тем, что вакцина дополнительно содержит пептон, желатозу и солевой буфер, а вирус осповакцины наработан на перевиваемых культурах клеток животных при следующем соотношении компонентов на одну таблетку, мас.%:

Лиофилизированный вирусный материал

осповакцины с активностью

6,5-8,0 lg ЦПД₅₀ на таблетку 1,04-31,3

Пептон 0,12-3,8

Желатоза 0,06-1,9

Сахароза 10,1-11,55

Буфер 0,001-0,027

Стеарат кальция 1,94-2,0

Ванилин 0,17-0,2

Лактоза Остальное до 100%