Изобретение относится к области медицины, а именно иммунологии, и может быть использовано для иммунопрофилактики вирусного гепатита В.
Гепатит В (ГВ) является одной из наиболее значимых проблем здравоохранения и военной медицины. При ежегодной заболеваемости в России 40000 человек число вирусоносителей в 100 раз больше. Заболеваемость имеет тенденцию к непрерывному росту. В 10% случаев формируется хронической гепатит, цирроз печени и гепатокарцинома. Имеются обширные группы повышенного риска инфицирования вирусом гепатита В (медперсонал, военнослужащие срочной службы, хронические больные и др.).
Эффективное воздействие на эпидемический процесс может быть достигнуто только с помощью вакцинопрофилактики. Применяющиеся сейчас вакцины гепатита В предназначены для парентерального применения, что требует достаточно трудоемкой и дорогой процедуры очистки действующего начала от балластных белков. Длительность курса иммунизации, сложность технологии получения парентеральных вакцин и высокая их стоимость определяют необходимость дальнейшего совершенствования средств и методов вакцинопрофилактики гепатита В (ГВ).
Одним из наиболее перспективных способов вакцинации является пероральный. Иммунизация этим физиологичным и простым способом не требует асептических условий, специального снаряжения и квалифицированного медперсонала, в то же время обеспечивается возможность быстро и безопасно привить большие контингенты людей.
Иммунитет слизистых оболочек при ГВ имеет немаловажную роль. Это связано с гемоконтактным способом передачи вируса ГВ. Исходя из этого, возрастает актуальность энтеральной иммунизации против ГВ, так как в силу взаимосвязанности иммунитета слизистых этот способ приводит к формированию секреторного иммунитета на всех слизистых оболочках организма.
В настоящее время существует множество вакцин против вирусного гепатита B, при этом чаще всего они представляют собой жидкую лекарственную форму, применяемую путем в/м или подкожного введения.
Известна композиция (вакцина) против вирусного гепатита В (HBsAg/ ayw), содержащая в 1 мл эффективное количество поверхностного антигена вируса гепатита В и вспомогательные вещества - адъювант, консервант, физиологически приемлемый разбавитель:
антиген вируса гепатита B, полученный путем культивирования штамма Saccharomуces cerevisiae ВКПМ 2-2203 - 20 мкг HBsAg/ayw
мертиолят Na - 0,005%
гель гидроокиси алюминия - 0,5 мг в пересчете на Al3+
Вакцина используется для профилактики вирусного гепатита B (RU 2088664, 1997, A 61 K 39/29).
Некоторые трудности, возникающие при работе с инъекционными формами, делают актуальной и перспективной работу, связанную с разработкой новых лекарственных форм.
Задачей изобретения является создание новой эффективной лекарственной формы вакцины для иммунопрофилактики вирусного гепатита B, обладающей стабильностью, длительностью хранения, удобством применения и не вызывающей при использовании побочных реакций.
При разработке композиции учитывалась совместимость входящих в нее ингредиентов, при этом обращалось особое внимание на подбор вспомогательных веществ, которые должны быть безвредными для организма и не оказывать неблагоприятного воздействия на антиген, в частности - не снижать его иммуногенные свойства.
Поставленная задача решена путем создания фармацевтической композиции для иммунопрофилактики вирусного гепатита B, которая содержит в качестве активного начала поверхностный антиген вирусного гепатита B и дополнительно белок дрожжей Saccharomyces cerevisiae, в качестве наполнителей и стабилизаторов - глюкозу и полиглюкин, при массовом соотношении глюкоза : полиглюкин, равном 1: 1 - 10:1. При этом композиция содержит все активные компоненты, глюкозу и полиглюкин в высушенном виде, при содержании в единице готовой формы 100-200 мкг HBsAg поверхностного антигена вируса гепатита B, 0,05-12 мг белка дрожжей Saccharomyces cerevisiae, 10-50 мас.% глюкозы с полиглюкином и вспомогательных веществ - до 100 мас.%.
В качестве поверхностного антигена гепатита В композиция предпочтительно содержит антиген, полученный культивированием штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ У-2203.
Композиция может быть выполнена в форме таблетки, покрытой оболочкой из ацетилфталилцеллюлозы массой 0,4 - 0,5% от суммы всех компонентов. При этом в качестве вспомогательных веществ она содержит 0,8 - 1 мас.% стеарата кальция и 50-55 мас.% обезвоженной лактозы.
Оболочка таблетки может содержать краситель КФ-6001 (Г.Р.96/283/15).
В фармацевтическую композицию могут быть введены другие активные компоненты, например, известные иммуномодуляторы, такие как имунофан (Г. Р. 96/283/2).
Фармацевтическая композиция может представлять собой свечи, эмульсии, суспензии, растворы. Указанные лекарственные формы получают традиционными способами с применением известных для них фармакологических приемлемых вспомогательных веществ: основ для свечей, эмульгаторов, растворителей, наполнителей, стабилизаторов, консервантов.
Для получения различных лекарственных форм используют сухую смесь (БП), содержащую поверхностный антиген вируса гепатита B, белок дрожжей Saccharomyces cerevisiae, глюкозу и полиглюкин. Указанный состав представляет собой смесь ингредиентов, используемых в качестве основы, вводимой в соответствующие каждой лекарственной форме вспомогательные вещества. Например, для получения свечей БП смешивают с маслом какао и используют ректально.
В качестве поверхностного антигена вируса гепатита B может быть антиген вируса гепатита В, получаемый путем культивирования любого известного штамма дрожжей, содержащего рекомбинантную плазмиду с геном HBsAg.
Например, может быть использован штамм Saccharomyces cerevisiae ДАН-041/рВМК 1 (ВКПМ N У-1875); ДАН-041/р23 (ВКПМ N У-2204); ДАН- 041/р20 (ВКПМ N У-2203) и др.
Конкретные примеры фармацевтической композиции, иллюстрирующие изобретение:
1. Свеча массой 2 г содержит:
Поверхностный антиген вируса гепатита B, полученный культивированием штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ NY-1875 - 100 мкг HBsAg
белок дрожжей Saccharomyces cerevisiae - 0,2 мг
глюкоза - 0,34 г
полиглюкин - 0,34 г
масло какао - до 2 г
2. Свеча массой 3 г содержит:
Поверхностный антиген вируса гепатита B, полученный культивированием штамма Saccharomyces cerevisiae ДАН-041/pBMK1 - 150 мкг HBsAg
белок дрожжей Saccharomyces cerevisiae - 0,3 мг
глюкоза - 0,3 г
полиглюкин - 0,3 г
масло кокосовое - до 3 г
3. Таблетка массой 0,2 г ± 0,01 г содержит:
Поверхностный антиген вируса гепатита B, полученный культивированием штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-2203 - 200 мкг HBsAg
белок дрожжей Saccharomyces cerevisiae - 0,4 мг
глюкоза - 0,049 г
полиглюкин - 0,049 г
стеарат кальция - 0,0016 г
обезвоженная лактоза - 0,1 г
ацетилфталилцеллюлоза - 0,0008 г
Качество таблетированной вакцины во многом зависит от состава таблеточной массы, включающей сухой биопрепарат и вспомогательные вещества. После смешивания сухого биопрепарата с этими веществами полученная смесь должна обладать определенными технологическими свойствами : сыпучестью, прессуемостью и другими. Кроме того, вещества, входящие в ее состав, должны быть безвредными для организма и не оказывать неблагоприятного воздействия на антиген.
Для приготовления таблеточной массы в качестве наполнителя наиболее пригодной оказалась лактоза, так как она обладает требуемыми сыпучестью, прессуемостью и невысокой гигроскопичностью. В качестве смазывающего агента использовали стеарат кальция. В качестве наполнителя и стабилизатора для сушки используют глюкозу и полиглюкин в соотношении 10:1 при контактном способе высушивания, а также белок Saccharomyces cerevisiae.
Содержание сухого биопрепарата в таблеточной смеси не должно превышать 50 процентов, так как дальнейшее увеличение его доли приводит к неравномерному наполнению матриц, налипанию на пуансоны пресса, разрушению таблеток, эффекту двойного прессования (табл. 1 и 2 см. в конце описания).
Процесс получения лекарственной формы препарата включает:
1) получение сухого биопрепарата (БП);
2) приготовление таблеточной смеси;
3) прессование;
4) нанесение кислотоустойчивой защитной оболочки.
При получении сухого БП и разработке композиционного состава таблетированной вакцины использовали следующие материалы:
1. Лактоза кристаллическая гидратная (ТУ 6-09-2293-77)
2. Глюкоза кристаллическая гидратная (ФС 42-2419-86)
3. Полиглюкин сухой (по ГФ XI ст. 5/41)
4. Ацетилфталилцеллюлоза (ФС 42-1945-82)
5. Спирт этиловый (ГОСТ 5967-67)
6. Ацетон (ГОСТ 2603-79)
7. Сухой лед (ГОСТ 12162-77)
8. Касторовое масло (ГОСТ 18102-72)
9. Стеарат кальция (ТУ 6-09-4233-76)
10. Тропеолин-о (Г.Р. 71223) или желтый водорастворимый краситель КФ-6001 (Г.Р. 96/283/15).
Для получения сухого БП, согласно изобретению, использовали жидкие препараты рекомбинантного дрожжевого HBsAg, например, полученные по патенту N 2088664, RU, фирмы "Комбиотех Лтд" с концентрацией антигена 70-100 мкг/мл и содержанием белка 50,0-4800 мкг/мл дрожжей Saccharomyces cerevisiae в определенном количестве (штамм Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-2203).
Авторами изобретения было установлено, что для целей получения сухого антигена вируса гепатита B лучше использовать антиген с меньшей степенью очистки, поскольку белок в данном случае играет роль стабилизатора антигенной активности и выступает в роли иммуномодулятора, улучшающего иммуногенные свойства антигена.
Было также установлено оптимальное его количество, обеспечивающее наибольшее сохранение активности антигена: 0,05-12 мг.
Для высушивания растворов HBsAg использовали сублимационный или контактно-сорбционный способы.
Сублимационное высушивание проводили на установке НЕТО InterMei (Дания) при температуре 18-20oC в течение 25-30 часов. Для этого растворы HBsAg разливали в ампулы ШПВ-3 по 0,5 мл. Учитывая малый сухой остаток в исходном растворе в качестве наполнителей и стабилизаторов использовали глюкозу и сухой полиглюкин.
Для изготовления экспериментальной серии препарата использовали 168 мл раствора рекомбинантного антигена, содержащего HBsAg 72 мкг/мл и 4,4 мг/мл белка Saccharomyces cerevisiae, прессование таблеток проводили на таблеточном прессе ТПК-12 с использованием матриц и пуансонов диаметром 12 мм.
Процесс получения таблетированной формы вакцины представлен в виде табл. 2.
Вследствие того, что действующее начало вакцины - HВsAg представляет собой гликопротеин, который в желудке может подвергаться неблагоприятному воздействию желудочного сока, на таблетку наносили защитное покрытие на основе ацетилфталилцеллюлозы (АФЦ), в которую добавляли красители. Кислотоустойчивое энтеросолюбельное покрытие на основе АФЦ наносили в установке псевдокипящего слоя "Strea-1"(Швейцария).
Полученная экспериментальная серия таблетированной вакцины против гепатита B на основе рекомбинантного дрожжевого HBsAg представляет собой двояковыпуклые таблетки круглой формы диаметром 12 мм массой 0,6 г желтого цвета с цельными краями и ровной блестящей поверхностью, что подтверждает возможность использования разработанного композиционного состава для получения таблетированной формы вакцины на основе рекомбинантного дрожжевого HBsAg.
Таблетки хранятся при температуре (+4)-(+2)oC в течение 3-х лет. Допускается переконтроль препарата по показателю специфической активности. При сохранении специфической активности на установленном уровне срок годности вакцины продлевается на 6 месяцев.
Разработанная таблетированная лекарственная форма с антигеном вируса гепатита B может быть использована для иммунопрофилактики по любой из известных схем иммунизации вакцинами против вируса гепатита B.
Иммуногенность таблетированной формы препарата устанавливали на кроликах. Животным массой 2,5 - 3 кг вводили в желудок таблетку вакцины с содержанием антигена 100 мкг. На 28 день после приема отбирали кровь и определяли сероконверсию методом ИФА по содержанию антител к HBsAg класса IgG. Процент сероконверсии составил 60%.
Изобретение может быть использовано в медицине для иммунопрофилактики вирусного гепатита В. Композиция содержит поверхностный антиген вируса гепатита В и белок дрожжей Saccharomyces cerevisiae в качестве активных веществ. В качестве наполнителей и стабилизаторов содержатся глюкоза и полиглюкин при их массовом соотношении 1:1-10:1. Указанные компоненты содержатся в высушенном виде. Кроме них в композиции содержатся вспомогательные вещества. В единице готовой формы содержится 100-200 мкг HBsAg поверхностного антигена вируса гепатита В, 0,05-12 мг белка дрожжей Saccharomyces cerevisiae, 10-50 мас.% глюкозы с полиглюкином и до 100 мас.% вспомогательных веществ. Антиген получен, в частности, культивированием штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ У-2203. В качестве вспомогательных веществ композиция может содержать 0,8-1 мас.% стеарата кальция, 50-55 мас.% обезвоженной лактозы и при этом выполнена в форме таблетки. Таблетка покрыта оболочкой из ацетилфталилцеллюлозы массой 0,4-0,5% от суммы всех компонентов таблетки. Композиция стабильна, подлежит длительному хранению, удобна в применении и не вызывает побочных реакций. Это устраняет некоторые трудности, возникающие при работе с инъекционными формами. Не требуются специальное снаряжение и квалифицированный персонал для иммунизации, более безопасная и быстрая прививка большого контингента людей. 5 з.п. ф-лы, 2 табл.
