СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОЙ КОРЕВОЙ ВАКЦИНЫ Российский патент 1998 года по МПК A61K9/20 A61K39/165 

Изобретение относится к медицине, в частности, к производству вирусных вакционных препаратов в таблетированной форме.

Известен способ получения живой коревой вакцины (ЖКВ) на основе любого вакционного штамма вируса кори. Способ включает культивирование вируса в культуре клеток эмбрионов японских перепелок, сбор вируссодержащей жидкости, введение стабилизатора и высушивание [1]. Вакцина индуцирует синтез гемагглютинирующих антител в организме человека и животных и обеспечивает протективный эффект. Стабилизатор содержит сорбит и желатозу.

Наиболее близким способом (прототипом) является традиционная технология получения ЖКВ путем размножения аттенуированного штамма Л-16 вируса кори на культуре фибробластов японских перепелов с последующим сбором вируссодержащей жидкости и ее очистки при помощи фильтрации или центрифугирования. В полученную субстанцию вводят стабилазатор, включающий сорбит и желатозу в конечной концентрации 5% или ЛС-18 и желатин. Продукт разливают в ампулы, лиофильно высушивают с последующей герметизацией ампул [2]. Перед применением вакцину разводят растворителем. Биологическая активность ЖКВ составляет 3,3-4,0 lg ТЦД₅₀/0,5 мл.

Недостатками известных способов (аналога и прототипа) получения ЖКВ [1, 2] является инъекционная форма применения ЖКВ, что создает угрозу заражения вирусами гепатита и ВИЧ при вакцинации, а также необходимость в специально оборудованных помещениях, большом количестве шприцов и игл, квалифицированном персонале для проведения вакцинаций и ревакцинаций.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка такого способа получения ЖКВ, который позволил бы изготавливать ЖКВ в таблетированной форме для перорального применения с использованием простого и экономичного технологического оборудования.

Указанная задача решается тем, что в способе получения живой коревой вакцины, включающем размножение вируса кори на клеточном субстрате, сбор вируссодержащей жидкости, освобождение продукта от клеточного детрита, введение в него стабилизирующего состава с последующей лиофилизацией препарата, согласно изобретению, сбор вируссодержащей жидкости осуществляют при достижении титра вируса не менее 5,0-6,0 lg ТЦД₅₀/0,5 мл и содержании белка не более 16 мкг/мл, в качестве стабилизирующего состава в вируссодержащую жидкость вводят сахарозу, желатозу и пептон до конечной их концентрации в смеси по 3 мас.% каждого компонента стабилизатора, после лиофилизации сухой вируссодержащий материал измельчают, смешивают с лактозой и стеаратом кальция при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Лиофилизированный вируссодержащий материал с активностью не менее 4,5 lg ТЦД₅₀/0,5 мл - 49 - 98
Лактоза - 0,1 - 49
Стеарат кальция - 1,5 - 2,5
Полученную массу таблетируют и таблетки покрывают кислотоустойчивой оболочкой на основе ацетилфталилцеллюлозы.

Вакцина, приготовленная предлагаемым способом, обладает выраженными иммуногенными свойствами, проверенными экспериментально на лабораторных животных. При производстве вакцины исключается дорогостоящие и трудоемкие этапы подготовки и стерилизации ампул, розлива вакцины в ампулы, их герметизации, приготовления и контроля растворителя, вследствие чего освобождается ряд производственных помещений и оборудования. Новая форма выпуска вакцины исключает возможность заражения вирусами гепатитов и ВИЧ при вакцинации, необходимость в оборудовании помещений для профилактических прививок, обеспечении инструментами, квалифицированным персоналом.

Совокупность существенных признаков предлагаемого изобретения, отличающихся от существенных признаков прототипа, неизвестна из опубликованных источников информации, что позволяет сделать вывод о соответствии технического решения критерию "изобретательский уровень".

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Приготовление таблетированной формы ЖКВ
Культуру клеток фибробластов японских перепелов получают путем трипсинизации эмбрионов раствором трипсина-версена при температуре + 37^oC. Клеточную взвесь центрифугируют, клетки ресуспендируют в ростовой среде и рассеивают в матрасы или роллеры из расчета 500 и 950 тыс. кл./мл соответственно. Выращивание проводят при 35^oC до образования монослоя. При суспензионном заражении вирус добавляют во взвесь клеток с множественностью заражения 0,1-0,001 ТЦД₅₀/кл. После образования монослоя клетки подвергают 6-кратным отмывкам для освобождения от балластных белков, далее культивируют при температуре (35±1)^oC и частоте вращения роллеров 2 - 12 об/мин. При появлении цитопатического действия вируса на клетки осуществляют сбор вируссодержащей жидкости с интервалом 1-3 суток с последующей заменой поддерживающей среды. Индивидуальные вирусные сливы с биологической активностью не ниже 5,0 lg ТЦД₅₀/0,5 мл объединяют и освобождают фильтрованием от клеточного детрита. В полученную суспензию добавляют стерильные растворы 50%-ной сахарозы, 25%-ной желатозы (мол. вес 3000) и 25%-ного пептона до конечной концентрации по 3% каждого соединения. Состав разливают в лотки по 1 л (толщина слоя жидкости 0,5 см) и замораживают при температуре -60^oC в течение 18 часов. Продукт лиофильно высушивают в течение 48 часов в стерильных условиях. Высушенный вируссодержащий материал измельчают, смешивают с лактозой и стеаратом кальция по 49,0%, 49,0% и 2,0% соответственно. Полученную массу таблетируют и таблетки покрывают кислотоустойчивой оболочкой на основе ацетилфталилцеллюлозы. Полученную вакцину контролируют по физико-химическим свойствам, содержанию посторонней микрофлоры, биологической активности, безвредности, антигенности, иммуногенности (на лабораторных животных).

Пример 2. Результаты оценки физико-химических свойств таблеток ЖКВ
Контроль таблетированной формы ЖКВ по физико-химическим свойствам проводят в соответствии с [2], остаточную влажность определяют по методу [3]. Средняя масса таблеток составляет 0,2 - 0,5 г, остаточная влажность - (1 - 3)%. Таблетки прочные, круглые, двояковыпуклой формы, без трещин, края круглые без выщербленных мест. Диаметр 5 мм. Таблетки не распадаются в течение 50 минут в 0,1N растворе соляной кислоты.

Пример 3. Определение биологической активности препарата
Для определения биологической активности вирус из таблетки извлекают в водную фазу (питательная среда, фосфатно-солевой буфер, 8%-ный водный раствор бикарбоната натрия с последующей нейтрализацией 0,1N соляной кислотой до pH 7,0-7,3), выделяют водную фазу центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут и титруют в 96-луночных культуральных планшетах на культуре клеток VERO по цитопатическому действию в соответствии с [2]. Биологическая активность таблетированной формы ЖКВ составляет 3,5 - 4,45 lg ТЦД₅₀/табл.

Пример 4. Определение содержания посторонней микрофлоры в ЖКВ
Методику проведения анализа на содержание в таблетках ЖКВ посторонней микрофлоры осуществляют в соответствии с Инструкцией [5].

Содержание посторонних микроорганизмов составляет 1 - 5 колоний на таблетку. Патогенных бактерий кишечной группы, золотистого стафилококка, синегнойной палочки не обнаружено.

Пример 5. Исследование препарата ЖКВ на токсичность
Токсичность на лабораторных животных определяют в соответствии с методикой [6]. Таблетки растирают в стерильной ступке с физиологическим раствором (5 мл/табл.), после отстаивания в течение 15 - 30 мин надосадочную жидкость вводят подкожно по 5 мл двум беспородным морским свинкам в возрасте 3 месяцев с массой тела 300 ± 50 г и по 0,2 мл пяти беспородным белым мышам в возрасте 2 месяца с массой тела 17 - 20 г. Все животные остались живы в течение 7 суток, масса каждого животного не уменьшилась по сравнению с исходной на день окончания эксперимента, на месте введения не развился абсцесс или некроз, не отмечено повышения температуры ни у одного животного.

Пример 6. Исследование иммуногенности препарата на животных
Контроль иммуногенности вакцины осуществляют на кроликах. Препарат вводят животным перорально. Исследования показывают влияние вакцины на стимуляцию гуморального и клеточного иммунитета животных (в реакциях пассивной агглютинации, торможения гемагглютинации, ИФА, бласттрансформации лимфоцитов периферической крови) на 14-21 день после вакцинации.

Экспериментальные исследования показывают, что таблетированная форма ЖКВ, приготовленная на основе сухого вируссосодержащего препарата (активность 4,5 lg ТЦВ₅₀/0,5 мл), полученного по традиционной технологии [1, 2] (со стабилизатором сорбит с желатозой или ЛС-18 с желатином) имеет биологическую активность 1,0 и 2,5 lg ТЦД₅₀/1 таблетку соответственно, что меньше одной прививочной дозы (2000 ТЦД₅₀). Предлагаемая технология получения таблетированной формы ЖКВ с использованием нового состава стабилизатора обеспечивает сохранение биологической активности вируссодержащего препарата.

Источники информации
1. Авторское свидетельство СССР N 278964, C 12 K 5/00, опубл. 1973 г., "Способ получения живой коревой вакцины" (аналог).

2. ФС 42 - 179 ВС - 88, "Вакцина коревая культуральная живая, сухая" (прототип).

3. Государственная Фармакопея СССР. - М., 1987. - 11 изд., в. 2, с. 156
4. Государственная Фармакопея СССР. - М., 1987. - 11 изд., в. 2, с. 196 - 209.

5. Сборник инструкций по общим методам контроля стерильности, физико-химических свойств, пирогенности, на отсутствие контаминирующих агентов и токсичности МИБП. Приказ М3 СССР N 31 от 13.01.1983.

Изобретение относится к медицине, в частности к производству вирусных вакцинных препаратов в таблетированной форме. Способ получения живой коревой вакцины включает размножение вируса кори на клеточном субстрате, сбор вируссодержащей жидкости, освобождение продукта от клеточного детрита, введение в него стабилизирующего состава с последующей лиофилизацией препарата. Сбор вируссодержащей жидкости осуществляют по достижении титра вируса не менее 5,0-6, lq ТЦД ₅₀/0,5 мл и содержании белка не более 16 мкг/мл, в качестве стабилизирующего состава в вируссодержащую жидкость вводят сахарозу, желатозу и пептон до конечной их концентрации в смеси по 3 мас.% каждого компонента стабилизатора. После лиофилизации сухой вируссодержащий материал измельчают, смешивают с лактозой и стеаратом кальция при следующем соотношении компонентов, мас.%: лиофилизированный вируссодержащий материал с активностью не менее 4,5 lq ТЦД₅₀/0,5 мл 49-98, лактоза 0,1-49, стеарат кальция 1,5-2,5. Полученную массу таблетируют и таблетки покрывают кислотоустойчивой оболочкой на основе ацетилфталилцеллюлозы. Технический результат: способ позволяет изготавливать живую коревую вакцину в таблетированной форме для перорального применения с использованием простого и экономичного технологического оборудования.

Способ получения живой коревой вакцины, включающий размножение вируса кори на клеточном субстрате, сбор вируссодержащей жидкости, освобождение продукта от клеточного детрита, введение в него стабилизирующего состава с последующей лиофилизацией препарата, отличающийся тем, что сбор вируссодержащей жидкости осуществляют по достижении титра вируса не менее 5 - 6 lg ТПД 50/0,5 мл и содержания белка не более 16 мкг/мл, в качестве стабилизирующего состава в вируссодержащую жидкость вводят сахарозу, желатозу и пептон до конечной их концентрации в смеси по 3 мас.% каждого компонента стабилизатора, после лиофилизации сухой вируссодержащий материал измельчают, смешивают с лактозой и стеаратом кальция при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Лиофилизированный вируссодержащий материал с активностью не менее 4,5 lg ТПД 50/0,5 мл - 49 - 98
Лактоза - 0,1 - 49
Стеарат кальция - 1,5 - 2,5
с последующим таблетированием полученной массы и покрытием кислотоустойчивой оболочкой на основе ацетилфталилцеллюлозы.