СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОКРАШЕННОЙ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 1997 года по МПК C08B37/08 A61K31/715 

Изобретение относится к химии полисахаридов и красителей, а именно к способу получения окрашенной гиалуроновой кислоты (ГК), которая может быть использована в качестве субстрата для количественного определения ферментов гиалуронидазного действия, а также в качестве маркеров для изучения различных физиологических процессов, протекающих в организме, и в качестве лечебного средства для использования в хирургии, гинекологии, дерматологии, урологии, офтальмологии, отоларингологии.

Известны способы окрашивания различных химических веществ, в том числе полисахаридов (1 3). Однако для окрашивания, как правило, используют токсичные синтетические красители, что ограничивает возможности их применения в биологии и медицине.

Наиболее близким к заявленному по технической сущности и достигаемому результату является способ получения окрашенных полисахаридов (4), выбранный нами за прототип, согласно которому полисахарид растворяют в воде при 50^oC, к раствору добавляют равный объем красителя ремазолового голубого, в течение следующих 40 мин добавляют электролит сульфат натрия, смесь инкубируют 75 80 мин при 50^oC, окрашенный полисахарид выделяют из смеси центрифугированием, промывают многократно метанолом и высушивают под вакуумом.

Недостатки известного способа заключаются в том, что используемый краситель ремазоловый голубой относится к числу высокотоксичных веществ, а получаемое соединение полисахарид-краситель является нестойким и быстро (за 1 1,5 месяца) обесцвечивается.

Изобретение решает задачу получения нетоксичного и устойчивого при длительном хранении окрашенного препарата ГК.

Указанный результат достигается тем, что в способе получения окрашенной ГК, включающем растворение ГК в воде при нагревании, последовательное добавление раствора красителя и электролита, инкубацию смеси, выделение окрашенной ГК, ее промывку и сушку, растворение ГК проводят при 95 100^oC и рН 8,0 8,5, в качестве красителя используют этакридина лактат (риванол), в качестве электролита применяют калия хлорид, для инкубации используют смесь, содержащую гиалуроновую кислоту, этакридинлактат (риванол) и хлорид калия в молярном соотношении 1 (0,5 0,6) (0,2 0,3) соответственно, а инкубацию осуществляют при 30 40^oC в течение 2 4 ч; для выделения окрашенной гиалуроновой кислоты применяют охлажденный до 4 10^oC ацетон в количестве 3 4 об. на 1 об. инкубационной смеси, а для промывки окрашенной гиалуроновой кислоты используют этанол.

Известно, что ГК, представляющая собой высокомолекулярный полисахарид, содержащий повторяющиеся фрагменты (см. формулу)

обладает высокой реакционной способностью (5). Установлено, что ГК реагирует с красителями посpедством неклеофильного присоединения по реакции Кр ( + ГК ОН __→ Кр Х О ГК) (6), где Х NH₂ или другая реактивная группа.

Однако проведенные нами исследования показали, что ряд красителей, например ремазоловый голубой, проционовый красный, реактановый красный, бриллиантовый зеленый, образуют нестойкие соединения с ГК и уже через несколько суток вышеописанная реакция приобретает обратимый характер.

Значительно более устойчивым оказалось соединение ГК с риванолом

в котором окрашенный комплекс образуется, по-видимому, за счет взаимодействия ОН-групп ГК с NH₂-группами риванола, что и предопределило наш выбор этого красителя.

При проведении реакции ГК с риванолом в водной среде при рН 8,0 8,5 и температуре 30 40^oC в течение 2 4 ч в присутствии KCl образуется устойчивое окрашенное в желто-оранжевый цвет соединение ГК при условии использования 0,5 0,6 мас.ч. красителя и 0,2 0,3 мас.ч. KCl на 1 мас.ч. ГК. В случае изменения этих соотношений в большую или меньшую сторону, а также в случае снижения или повышения времени и параметров реакции (рН среды, температура) комплекс ГК краситель либо не образуется, либо быстро обесцвечивается при хранении.

Что касается выделения окрашенной ГК, то лучшие результаты были достигнуты при осаждении окрашенной ГК 3 4 об. охлажденного до 4 10^oC ацетона, с последующей многократной промывкой осадка этанолом до полного обесцвечивания надосадочной жидкости. При использовании других органических растворителей возникла необходимость применять значительно большие их количества, а целевой продукт приобретал токсические свойства.

Важно подчеркнуть, что получаемый окрашенный препарат ГК оказывает противомикробные действие и не вызывает токсических явлений при обработке живых тканей.

Пример 1. 1 г ГК (использовали отечественный препарат Гиалуроновой кислоты по ТУ 9185-00317204830-93) суспендируют с 100 мл воды, подщелачивают 1 н раствором NaOH до рН 8,0, медленно нагревают до 95^oC, раствор охлаждают до 30^oC, добавляют раствор 0,5 г этакридина лактата (риванола) в 100 мл воды (массовое соотношение ГК-краситель 1 0,5), затем добавляют 0,2 г KCl (массовое соотношение ГК-КС 1 0,2), смесь инкубируют при 30^oC в течение 2 ч и вливают в 600 мл (3 об.) охлажденного до 4^oC ацетона, образовавшийся осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин и многократно (5 6 раз) промывают этанолом до полного обесцвечивания надосадочной жидкости. Получают 1,5 г (выход 88,2%) порошка желто-оранжевого цвета без запаха, не обесцвечивающегося при хранении в условиях комнатной температуры в течение 1 года.

Пример 2. 1 г ГК суспендируют в 100 мл воды, подщелачивают 1 н раствором NaOH до рН 8,25, медленно нагревают до 97^oC, раствор охлаждают до 35^oC, добавляют раствор 0,55 г риванола в 100 мл воды (мас. соотношение 1:0,55), затем добавляют 0,25 г KCl (мас. соотношение 1 0,25), cмесь инкубируют при 35^oC в течение 3 ч и вливают в 700 мл (3,5 об.) охлажденного до 7^oC ацетона, образовавшийся осадок отделяют центрифугированием (3000 об/мин, 15 мин) и многократно (5 6 раз) промывают этанолом до полного обесцвечивания надосадочной жидкости. Получают 1,62 г (выход 90,1%) порошка желто-оранжевого цвета без запаха, не обесцвечивающегося при хранении в условиях комнатной температуры в течение 1 года.

Пример 3. 1 г ГК суспендируют в 100 мл воды, подщелачивают 1 н NaOH до рН 8,5, медленно нагревают до 100^oC, охлаждают до 40^oC, добавляют раствор 0,6 г риванола в 100 мл воды (мас. соотношение 1 0,6), затем добавляют 0,3 г KCl (мас. соотношение 1 0,3), инкубируют при 40^oC 4 ч и вливают в 800 мл (4 об. ) охлажденного до 10^oC ацетона, осадок отделяют центрифугированием (3000 об/мин, 15 мин) и многократно (5 6 раз) промывают этанолом. Получают 1,72 г (выход 90,8% ) порошка желто-оранжевого цвета без запаха, устойчивого при комнатной температуре в течение 1 года.

Сопоставительный анализ технико-экономических показателей заявляемого объекта и известного способа приведен в таблице.

Т.о. заявленный способ позволяет получать окрашенный препарат ГК, устойчивый при длительном хранении, не токсичный и обладающий выраженным противомикробным действием.

Использование: изготовление субстратов для количественного определения ферментов и лекарственных средств. Сущность изобретения: способ получения окрашенной гиалуроновой кислоты, включающий растворение гиалуроновой кислоты в воде при 95 - 100^oC и рН 8,0 - 8,5, последовательное добавление к полученному раствору красителя - этакридинлактата (риванола) и электролита - хлорида калия, инкубацию смеси, содеpжащей гиалуроновую кислоту, этакридинлактат и хлорид калия в массовом соотношении 1:(0,5 - 0,6):0,2 ^oC 0,3) соответственно, при 30 - 40^oC в течение 2 - 4 ч, для выделения окрашенной гиалуроновой кислоты применяют охлажденный до 4 - 10^oC ацетон в количестве 3 - 4 об. на 1 об. инкубационной смеси, а для промывки окрашенной гиалуроновой кислоты используют этанол. 1 табл.

Способ получения окрашенной гиалуроновой кислоты, включающий растворение гиалуроновой кислоты в воде при нагревании, последовательное добавление к раствору гиалуроновой кислоты красителя и электролита, инкубацию смеси, выделение окрашенной гиалуроновой кислоты, промывку и сушку, отличающийся тем, что растворение гиалуроновой кислоты в воде проводят при 95 100^oС и рН 8,0 8,5, в качестве красителя используют этакридинлактат (риванол), в качестве электролита применяют хлорид калия, для инкубации используют смесь, содержащую гиалуроновую кислоту, этакридинлактат (риванол) и хлорид калия в массовом соотношении 1 (0,5 0,6) (0,2 0,3) соответственно, инкубацию осуществляют при 30 40^oС в течение 2 4 ч, для выделения окрашенной гиалуроновой кислоты применяют охлажденный до 4 10^oС ацетон в количестве 3 4 объема на 1 объем инкубационной смеси, а для промывки окрашенной гиалуроновой кислоты используют этанол.